En protokol til kortlægning af den tredimensionelle genomorganisation med nukleosomopløsning ved hjælp af den genom-dækkende kromosomkonformationsfangstmetode Micro-C-XL præsenteres her.
Tredimensionel (3D) kromosomorganisation er en vigtig faktor i genomregulering og celletypespecifikation. For eksempel menes cis-regulerende elementer, kendt som forstærkere, at regulere aktiviteten af distale promotorer via interaktion i 3D-rum. Genom-wide chromosome conformation capture (3C)-teknologier, såsom Hi-C, har ændret vores forståelse af, hvordan genomer er organiseret i celler. Den nuværende forståelse af 3D-genomorganisation er begrænset af den opløsning, hvormed den topologiske organisering af kromosomer i 3D-rummet kan løses. Micro-C-XL måler kromosomfoldning med opløsning på niveauet af nukleosomet, den grundlæggende enhed af kromatin, ved at anvende mikrokoknuklease (MNase) til at fragmentere genomer under kromosomkonformationsoptagelsesprotokollen. Dette resulterer i et forbedret signal-støj-forhold i målingerne, hvilket letter bedre detektion af isoleringssteder og kromosomsløjfer sammenlignet med andre genomdækkende 3D-teknologier. En visuelt understøttet, detaljeret, trinvis protokol til fremstilling af Micro-C-XL-prøver af høj kvalitet fra pattedyrceller præsenteres i denne artikel.
Micro-C-XL er en genom-dækkende teknik til måling af 3D-genomkonformation med nukleosomopløsning. Micro-C-XL bygger på den udbredte nærhedsligationsbaserede Hi-C-teknologi, som har transformeret vores forståelse af, hvordan 3D-genomer er organiseret1. Micro-C-XL og dets første iteration, Micro-C, blev oprindeligt udviklet i Saccharomyces cerevisiae2,3 og senere tilpasset pattedyrs cellesystemer, for hvilke protokollen har vist sit fulde potentiale til at detektere kortrækkende træk ved 3D-genomet, såsom kromosomsløjfer og isoleringssteder. Denne version er baseret på nyere Micro-C-XL-publikationerfra pattedyr 4,5. Da Micro-C-XL erstatter Micro-C, omtales Micro-C-XL fremover som Micro-C i manuskriptet.
De største forskelle mellem Micro-C og Hi-C6 er som følger: 1) genomfragmentering med mikrokoknuklease (MNase) sammenlignet med restriktionsenzymer og 2) yderligere tværbindinger med større atomafstand mellem de reaktive grupper sammenlignet med kun formaldehyd. Begge trin bidrager væsentligt til det forbedrede signal-støj-forhold for Micro-C sammenlignet med konventionel Hi-C. Fragmenteringsstørrelsen begrænser den opløsning, som 3D-genomorganisationen kan løses til under nærhedsligeringsprotokollen. MNase er en nuklease, der fortrinsvis fordøjer tilgængeligt DNA og efterlader nukleosomalt beskyttet DNA intakt. Nukleosomfodaftryk ved hjælp af MNase-sekventering har vist, at nukleosomer fuldt ud dækker de fleste eukaryote genomer7. Da nukleosomer fordeles i hele genomet med en gennemsnitlig afstand på 160-220 bp, afhængigt af art og celletype, er MNase det ideelle enzym til kortlægning af genomarkitekturen i høj opløsning.
Anvendelsen af en yderligere tværbinding i kombination med formaldehyd (FA) i Micro-C-metoden forbedrer yderligere signal-støj-forholdet 2,8. Aminspecifikke tværbindinger med længere atomafstandsstykker mellem de reaktive grupper letter protein-protein-tværbindinger. Disse er typisk disuccinimidylglutarat (DSG) eller ethylenglycol bis-succinimidylsuccinat (EGS) med henholdsvis 7,7 Å og 16,1 Å afstandsstykker. Reduktionen af støj gennem EGS eller DSG er særlig tydelig i eksperimenter med høje fragmenteringshastigheder, såsom Micro-C, og forekommer formodentlig på grund af en reduktion i hastigheden af tilfældige ligeringshændelser8.
En nyligt udviklet Hi-C 3.0-protokol, der anvender ESG/DSG-tværbinding og flere kombinationer af restriktionsenzymer, reducerer støj i Hi-C-eksperimenter og forbedrer signifikant påvisningen af kromosomsløjfer og isoleringssteder 8,9. Alligevel fandt en sammenligning sted for sted af forskellige interaktionsdatafunktioner, at Micro-C havde overlegen detektion af kortrækkende funktioner, såsom kromosomsløjfer og isoleringssteder, sammenlignet med både Hi-C 3.0 og konventionel Hi-C8. Hi-C 3.0 forbedrer imidlertid detektionen af kortrækkende funktioner og opretholder stærk detektion af genomopdeling sammenlignet med konventionel Hi-C. Sammenfattende bør valget af en kromosomkonformationsfangstmetode bestemmes af det objektive og biologiske spørgsmål.
Her leverer vi en trin-for-trin protokol til vellykkede Micro-C-eksperimenter, der kan optrævle 3D-genomorganisation.
Succesen med et Micro-C-eksperiment afhænger af et par kritiske trin i protokollen, der skal udføres omhyggeligt. For det første kan tværbinding med den ekstra tværbinding DSG eller EGS føre til aggregering af celler afhængigt af celletypen. Tilføjelse af 0,1% -0,5% BSA til tværbindingsreaktionen reducerer aggregeringen betydeligt uden at påvirke tværbindingseffektiviteten. Ineffektiv tværbinding kan resultere i øgede hastigheder af transkromosomale interaktioner, der er tegn på tilfældige ligationer. Det andet, men mest afgørende trin i denne protokol er fordøjelsen af kromatin med MNase. Suboptimal kromatinfordøjelse fører til ineffektiv nærhedsligering (overfordøjelse) eller øgede hastigheder af ikke-nærhedsligerede dinukleosomer (underfordøjelse). Effektiviteten af ligeringsreaktionen kan evalueres ved agarosegelelektroforese (figur 1B) og estimeres desuden bedst ved sekventering med lavt input. Hvis sekventering med lavt input afslører enten en høj duplikeringshastighed (ineffektiv ligering) eller øgede dinukleosomhastigheder, bør MNase-fordøjelsesgraden revurderes. Især kan tabet af prøve ved udførelse af protokollen føre til reduceret bibliotekskompleksitet. Koncentrationen af en prøve evalueres bedst efter DNA-oprensning (trin 5.3) eller ved minimal PCR (trin 8). Det samlede udbytte af DNA fra 5 x 106 pattedyrceller efter DNA-oprensning er typisk >2 μg. DNA-koncentrationen bør kontrolleres efter MNase-fordøjelsen, ExoIII-fordøjelsen og DNA-oprensningen. Endogene nukleaser, hvis overflod er celletypespecifik og artsspecifik, kan være en kilde til DNA-nedbrydning. Derudover kan kolonnebaseret DNA-oprensning føre til prøvetab på grund af uforenelighed med SDS fra deproteineringsreaktioner. Ethanoludfældning kan overvejes, hvis DNA-koncentrationen er lav på dette trin.
Da Micro-C kræver prøvespecifik MNase-titrering, er det udfordrende at anvende Micro-C på småcellepopulationer, såsom med små organer fra forskellige modelorganismer, embryoner og enkeltceller, organoider eller patientbiopsier. Her tilbyder Hi-C 3.0 et veletableret alternativ ved hjælp af en endepunktsreaktion ved sekvensspecifikke restriktionsendonukleaser 8,9.
Micro-C er en bredt anvendelig højopløsningskromosomkonformationsteknologi med et højt dynamisk område og et lavt signal-støj-forhold, hvilket gør den særligt velegnet til undersøgelse af kortrækkende kromosomfunktioner 4,5,8, såsom kromosomsløjfer. Opløsningen af Micro-C giver mulighed for at fange promotor-forstærkersløjfer, som ligger uden for detektionsgrænsen for Hi-C, hvilket effektivt muliggør en mere detaljeret analyse af forholdet mellem genomorganisation og regulering13,14,15. Desuden er DNA-fangststrategier for nylig blevet kombineret med Micro-C for at øge den locus-specifikke opløsning af det målrettede genomiske loci til hidtil usete niveauer, hvilket afslører ny indsigt i ultrastrukturen af 3D-genomet16,17,18. Sammenfattende forestiller vi os, at Micro-C og dets derivater vil være en nøgleteknologi til dissekering af 3D-genomets rolle i transkriptionel regulering og følgelig celletypedifferentiering og vedligeholdelse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christl Gaubitz og Kathleen Stewart-Morgan for deres kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker Anja Groth og Groth-laboratoriet for deres støtte til etableringen af vores laboratorium. Vi takker medarbejderne på CPR/reNEW Genomics Platform for støtte: H. Wollmann, M. Michaut og A. Kalvisa. Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) er støttet af Novo Nordisk Fondens bevillingsnummer NNF21CC0073729. Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (CPR) er støttet af Novo Nordisk Fondens bevillingsnummer NNF14CC0001. Vi takker Brickman-laboratoriet på Novo Nordisk Center for Stamcellemedicin, reNEW Copenhagen, for musens ES-celler.
1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
1x LIF | |||
2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
CaCl2 | |||
cell counter | |||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
mouse embryonic stem cells | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
Tris | Merck | 10708976001 | |
Trypsin | |||
Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
Fragment Analyzer |