Pupilometria para Avaliar a Sensação Auditiva em Cobaias

Summary

A pupillometry, uma técnica simples e não invasiva, é proposta como método para determinar limiares auditivos com ruído em animais normo-ouvintes e modelos animais de várias patologias auditivas.

Abstract

A exposição ao ruído é uma das principais causas de perda auditiva neurossensorial. Modelos animais de perda auditiva induzida por ruído geraram uma visão mecanicista sobre as patologias anatômicas e fisiológicas subjacentes da perda auditiva. No entanto, relacionar déficits comportamentais observados em humanos com perda auditiva com déficits comportamentais em modelos animais permanece desafiador. Aqui, a pupilometria é proposta como um método que permitirá a comparação direta de dados comportamentais animais e humanos. O método baseia-se em um paradigma excêntrico modificado – habituando o sujeito à apresentação repetida de um estímulo e apresentando intermitentemente um estímulo desviante que varia de alguma forma paramétrica do estímulo repetido. A premissa fundamental é que, se a mudança entre o estímulo repetido e desviante for detectada pelo sujeito, ela desencadeará uma resposta de dilatação da pupila maior do que a provocada pelo estímulo repetido. Essa abordagem é demonstrada por meio de uma tarefa de categorização de vocalização em cobaias, modelo animal amplamente utilizado em pesquisas auditivas, inclusive em estudos de perda auditiva. Ao apresentar vocalizações de uma categoria de vocalização como estímulos padrão e uma segunda categoria como estímulos excêntricos embutidos no ruído em várias relações sinal-ruído, demonstra-se que a magnitude da dilatação da pupila em resposta à categoria excêntrico varia monotonicamente com a relação sinal-ruído. As análises da curva de crescimento podem então ser usadas para caracterizar o curso do tempo e a significância estatística dessas respostas de dilatação da pupila. Neste protocolo, são descritos procedimentos detalhados para aclimatar cobaias à configuração, realizar pupilometria e avaliar/analisar dados. Embora esta técnica seja demonstrada em cobaias ouvintes normais neste protocolo, o método pode ser utilizado para avaliar os efeitos sensoriais de várias formas de perda auditiva dentro de cada sujeito. Esses efeitos podem então ser correlacionados com medidas eletrofisiológicas concomitantes e observações anatômicas post-hoc.

Introduction

O diâmetro da pupila (DP) pode ser afetado por um grande número de fatores e a medida da DP que muda ao longo do tempo é conhecida como pupilometria. A DP é controlada pelo músculo do esfíncter da íris (envolvido na constrição) e pelo músculo dilatador da íris (envolvido na dilatação). O músculo de constrição é inervado pelo sistema parassimpático e envolve projeções colinérgicas, enquanto o dilatador da íris é inervado pelo sistema simpático envolvendo projeções noradrenérgicas e colinérgicas ^1,2,3. O estímulo mais conhecido para induzir alterações da DP é a luminância-constrição e as respostas de dilatação da pupila podem ser produzidas por variações na intensidade da luz ambiente². A DP também muda em função da distância focal². Sabe-se há décadas, no entanto, que a DP também apresenta flutuações não relacionadas à luminância 4,5,6,7. Por exemplo, mudanças nos estados mentais internos podem provocar alterações transitórias da DP. A pupila dilata-se em resposta a estímulos emocionalmente carregados ou aumenta com a excitação 4,5,8,9. A dilatação da pupila também pode estar relacionada a outros mecanismos cognitivos, como o aumento do esforço mental ou da atenção^10,11,12,13. Devido a essa relação entre as variações do tamanho da pupila e os estados mentais, as alterações da DP têm sido exploradas como marcadores de distúrbios clínicos como esquizofrenia 14,15, ansiedade^16,17,18, doença de Parkinson ^19,20 e doença de Alzheimer ²¹ , entre outros. Em animais, as alterações da DP acompanham estados comportamentais internos e estão correlacionadas com os níveis de atividade neuronal em áreas corticais 22,23,24,25. O diâmetro da pupila também demonstrou ser um indicador confiável do estado de sono em camundongos²⁶. Essas mudanças de DP relacionadas à excitação e ao estado interno geralmente ocorrem em longas escalas de tempo da ordem de várias dezenas de segundos.

No domínio da pesquisa auditiva, tanto na audição normal quanto em indivíduos com deficiência auditiva, o esforço auditivo e a percepção auditiva têm sido avaliados por meio da pupilometria. Esses estudos geralmente envolvem sujeitos de pesquisa treinados^27,28,29,30 que realizam vários tipos de tarefas de detecção ou reconhecimento. Devido à relação supracitada entre excitação e DP, o aumento do engajamento da tarefa e do esforço de escuta tem se mostrado correlacionado com o aumento das respostas de dilatação pupilar 30,31,32,33,34,35. Assim, a pupilometria tem sido utilizada para demonstrar que o aumento do esforço de escuta é despendido para reconhecer a fala espectralmente degradada em ouvintes normo-ouvintes^29,36. Em ouvintes com deficiência auditiva, como humanos com perda auditiva relacionada à idade 27,30,37,38,39,40,41 e usuários de implante coclear ^42,43, as respostas dos alunos também aumentaram com a diminuição da inteligibilidade de fala; no entanto, os ouvintes com deficiência auditiva apresentaram maior dilatação pupilar em condições de escuta mais fáceis em comparação com os indivíduos normo-ouvintes 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Mas experimentos que exigem que o ouvinte execute uma tarefa de reconhecimento nem sempre são possíveis – por exemplo, em bebês ou em alguns modelos animais. Assim, as respostas não relacionadas à luminância das pupilas evocadas por estímulos acústicos poderiam ser um método alternativo viável para avaliar a detecção auditiva nesses casos^44,45. Estudos anteriores demonstraram uma dilatação pupilar transitória e ligada a estímulos como parte do reflexo orientador⁴⁶. Estudos posteriores demonstraram o uso de dilatações pupilares ligadas a estímulos para derivar curvas de sensibilidade de frequência em corujas^47,48. Recentemente, esses métodos foram adaptados para avaliar a sensibilidade da resposta de dilatação da pupila em lactentes humanos⁴⁸. A pupilometria tem se mostrado uma abordagem confiável e não invasiva para estimar os limiares de detecção e discriminação auditiva em cobaias (GPs) que ouvem passivamente, utilizando uma ampla gama de estímulos simples (tons) e complexos (vocalizações GP)⁴⁹. Essas alterações de DP relacionadas ao estímulo geralmente ocorrem em escalas de tempo mais rápidas da ordem de vários segundos e estão ligadas ao tempo do estímulo. Aqui, a pupilometria de alterações da DP relacionadas a estímulos é proposta como um método para estudar os impactos comportamentais de vários tipos de deficiência auditiva em modelos animais. Em particular, os protocolos de pupilometria para uso em GPs, um modelo animal bem estabelecido de vários tipos de patologias auditivas 50,51,52,53,54,55,56 (ver também a referência ⁵⁷ para uma revisão exaustiva) é descrito.

Embora esta técnica seja demonstrada em clínicos gerais de audição normal, esses métodos podem ser facilmente adaptados a outros modelos animais e modelos animais de várias patologias auditivas. É importante ressaltar que a pupilometria pode ser combinada com outras medidas não invasivas, como o EEG, bem como com registros eletrofisiológicos invasivos, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a possíveis déficits de detecção e percepção sonora. Finalmente, essa abordagem também pode ser usada para estabelecer amplas semelhanças entre modelos humanos e animais.

Protocol

Para todos os procedimentos experimentais, obtenha a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e siga as Diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Nos Estados Unidos da América, os GPs também estão sujeitos aos regulamentos do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA). Todos os procedimentos deste protocolo foram aprovados pela IACUC da Universidade de Pittsburgh e aderiram às Diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Para e…

Representative Results

A pupilometria foi realizada em três GPs pigmentados do sexo masculino, pesando ~600-1.000 g ao longo dos experimentos. Conforme descrito neste protocolo, para estimar os limiares de categorização call-in-noise, um paradigma excêntrico foi utilizado para a apresentação do estímulo. No paradigma excêntrico, chamadas pertencentes a uma categoria (wheeks) embutidas em ruído branco em um determinado SNR foram empregadas como estímulos padrão (Figura 2A), e chamadas de outra categoria (wheeks) embutidas em ruído b…

Discussion

Este protocolo demonstra o uso da pupilometria como método não invasivo e confiável para estimar limiares auditivos em animais ouvintes passivos. Seguindo o protocolo aqui descrito, foram estimados os limiares de categorização call-in-noise em GPs ouvintes normais. Os limiares estimados por meio da pupilometria mostraram-se consistentes com os obtidos com o treinamento operante⁶². Em comparação com o treinamento operante, no entanto, o protocolo de pupilometria foi relativamente simples e r…

Materials

Analog output board	Measurement Computing Corporation, Norton, MA	PCI-DDA02/12
Anechoic foam	Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone	Behringer, Willich, Germany	C-2
Free-field microphone	Bruel & Kjaer, Denmark)	Type 4940
Matlab	Mathworks, Inc., Natick, MA		2018a version
Monocular remote camera and illuminator system	Arrington Research, Scottsdale, AZ	MCU902	Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device	National Instruments, Austin, TX	PCI-6229
Neural interface processor	Ripple Neuro, Salt Lake City, UT	SCOUT
Piezoelectric motion sensor	SparkFun Electronics, Niwot, CO	SEN-10293
Pinch valve	Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL	EW98302-02
Programmable attenuator	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL	PA5
Silicon Tubing	Cole-Parmer		~3 mm
Sound attenuating chamber	IAC Acoustics
Speaker full-range driver	Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan	W4-1879
Stereo Amplifier	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL	SA1
Tabletop – CleanTop Optical	TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software	ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ