본 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 대뇌 오가노이드의 재현 가능한 생성, 유지 및 노화를 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 방법은 장기간 대뇌 오가노이드를 배양하고 성숙시킬 수 있어 뇌 노화 및 노화 관련 병인과 관련된 과정의 모델링을 용이하게 합니다.
현재 이용 가능한 동물 및 세포 모델은 노화 된 인간 뇌에서 일어나는 변화의 복잡성을 완전히 요약하지 못합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 인간 대뇌 오가노이드의 생성을 설명하는 절차의 최근 개발은 인간 뇌 및 관련 병원성 과정의 노화를 모델링하고 이해하는 능력을 근본적으로 변화시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 인간 iPSC 유래 대뇌 오가노이드의 생성, 유지, 노화 및 특성화를 위한 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 방식으로 뇌 오가노이드를 생성하기 위해 구현될 수 있으며 배양에서 오가노이드 성숙 및 노화를 개선하는 최신 기술을 통합하는 단계별 가이드 역할을 합니다. 오가노이드 성숙, 괴사, 변동성 및 배치 효과와 관련된 특정 문제가 해결되고 있습니다. 종합하면, 이러한 기술 발전은 다양한 젊은이와 노인 인간 기증자뿐만 아니라 노화 관련 뇌 질환을 앓고 있는 개인으로부터 파생된 오가노이드의 뇌 노화를 모델링하여 인간 뇌 노화의 생리학적 및 병원성 메커니즘을 식별할 수 있게 합니다.
노화 질병 모델은 인간의 기대 수명이 계속 증가함에 따라 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 대규모 게놈 연구를 통해 분자 과정의 조절 장애와 삶의 질에 영향을 미치는 유전적 변화가 있는 고령 인구가 발견되었습니다1. 노화 과정은 인지 기능 상실, 신경퇴행성 질환 위험 증가, 다수의 만성 질환 등 유기체의 전반적인 기능 상실을 특징으로 한다2.
현재의 세포 배양 기술은 돌연변이, 독소 또는 감염을 사용하여 이러한 기능 장애를 적절하게 복제할 수 없기 때문에 노화의 다인성 특성을 적절하게 나타내지 않습니다3. 노화 과정을 탐구하는 동물 모델은 종종 긴 실험 시간과 높은 비용과 관련이 있지만 윤리적 고려 사항도 함께 가져옵니다. 환자의 유도만능줄기세포(유도만능줄기세포, iPSC)를 사용하면 iPSC가 세포가 성숙한 조직으로 자연적으로 발달할 수 있기 때문에 질병 진행의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있다3. iPSC는 신경퇴행성 질환을 연구하는 많은 실험실에서 사용하게 되었는데, 이는 수확된 세포의 세포 재프로그래밍이 기증자의 질병이나 노화 흔적을 지우지 않는 것처럼 보이기 때문이다4. 이러한 각인은 인간 및 동물 모델에서 입증된 세포 표현형을 요약하여 iPSC를 고밀도 뇌 조직의 개별 세포 악화를 검사하는 데 적합하게 만듭니다 5,6. IPSC 유래 오가노이드는 조직의 3차원 배양을 위한 탁월한 모델이 되어 보다 복잡한 세포 간 상호 작용과 개선된 발달 요약을 가능하게 합니다. 오가노이드는 주로 발달 데이터에 사용되지만, 질병 모델링, 특히 염증, 신경변성 및 노화 모델에 점점 더 많이 적용되고 있다7. 이전의 iPSC 연구를 기반으로 오가노이드는 조직과 같은 네트워크 연결의 생리학적 맥락에서 질병 표현형과 세포 표현형을 유지합니다 8,9. 그러나 특정 치수의 3차원 조직을 배양하는 것은 특히 오랜 기간 동안 어려울 수 있습니다.
이 연구는 조직이 더 오랜 기간 동안 크기가 상당히 성숙할 수 있도록 하는 대뇌 오가노이드의 재현 가능한 생성에 대한 자세한 방법을 제시합니다. 대뇌 오가노이드 생성은 몇 가지 저명한 프로토콜의 방법을 채택하여 비교적 표준화된 상태로 유지되었습니다10,11. 그러나 차별화 및 유지 관리를 개선하기 위해 몇 가지 수정 사항이 제안되었습니다. 이러한 대체 방법으로는 신경 분화를 강화하기 위한 신경성 인자를 사용하는 것12, 세포 수명을 촉진하는 영양소 교환 개선을 위한 추가 스캐폴드13, 배양 및 성장 연장을 위한 저스트레스 교반14 등이 있다. 이러한 개선 사항은 신경퇴행성 및 노화 표현형을 발현할 수 있는 성숙한 오가노이드를 개발하기 위해 이 방법에 통합되었습니다.
EB의 표준화된 형성은 만능 줄기 세포를 뇌 오가노이드로 재현 가능한 전환시키는 데 중요한 단계입니다. 줄기 세포가 단일 조직으로 강제로 응집되는 것은 오목한 우물의 기하학적 구조, 파종 밀도 및 우물 처리에 따라 달라질 수 있습니다. 현재의 방법은 6일 후 500-600 μm의 직경 범위를 인용하지만, 다른 많은 직경이 성공적인 것으로 입증되었기 때문에 이러한 직경은 적절한 오가노이드 형성의 다른 직경을 배제하지 않습니다. 그러나 다양한 직경이 차별화 속도와 성공에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다29. 재현성을 위해 50 μm 미만의 직경 변화를 적극 권장합니다20. 또한, SMAD 억제제를 사용하면 노출 후 5일 만에 신경상피 형성을 효율적으로 생성하고 유지하는 것으로 나타났기 때문에 신경 유도 일수를 6일에서 10일로 연장하여 EB의 직경이 성장할 수 있습니다30. SMAD 억제제가 없는 경우 신경 유도는 일관되지 않은 결과를 생성할 수 있으며 더 긴 유도 기간이 필요합니다. 이 연구에서 인용 된 SMAD 억제제가 가장 효과적이지만 다른 도르 소 모르핀 및 TGF-β 소분자를 유효 농도로 사용할 수 있습니다.
기저막 매트릭스는 성장을위한 우수한 기질을 제공하며 다르게 투여 할 수 있습니다. 매트릭스의 초기 용도는 웰 코팅(31)으로서 기저막을 포함하였다. 그러나, 조직을 포매하기 위한 매트릭스의 사용은 이들 조직에서 분화 및 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다32. 오가노이드의 경우, 매트릭스를 사용하면 EB가 오가노이드로 분화되는 것을 개선하고, 성숙을 촉진하며, 배양 기간을 연장하는 것으로 나타났다33. 오가노이드는 매트릭스 없이도 형성될 수 있지만, 많은 그룹이 매트릭스가 없는 조직 배양을 달성하기 위해 노력했기 때문에34,35, 연구에 따르면 매트릭스 포매 오가노이드는 배양 시간이 길어질 가능성이 더 높고 유지 관리가 덜 필요하다는 사실이 밝혀졌습니다 36. 딤플 포매 방법은 오가노이드 표면의 동일한 커버리지를 제공하여 유사한 확산, 영양소에 대한 접근 및 재현 가능한 분화를 보장합니다. 대안적으로, 돔 임베딩은 오가노이드(37)를 완전히 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다.
EB를 멤브레인 매트릭스 딤플로 전달하는 것은 중요한 단계입니다. 1mL 피펫 팁은 EB를 이송할 수 있을 만큼 충분히 넓은 입구를 가지고 있지만, 이송의 용이성을 위해 200μL 팁이 선호됩니다. 200 μL 팁을 절단하여 충분히 큰 개구부를 만들어야 하며, 피펫팅 시 전단 응력을 줄이기 위해 가장자리가 매끄럽게 보장됩니다. 또는 쉽게 이동할 수 있도록 광구경 200μL 팁이 있습니다. 빠른 피펫팅은 오가노이드 주변을 방해하고 적절한 성장을 방해할 수 있으므로 천천히 수행해야 합니다. 영양분을 공급하기에 충분한 배지가 옮겨지도록 특별한 주의를 기울여야 합니다. 배지가 너무 적으면 오가노이드가 건조되어 괴사를 일으킬 위험이 있습니다. 너무 많은 배양 배지로 EB를 옮기면 매트릭스가 너무 희석되어 오가노이드를 안전하게 캡슐화하지 못할 수 있습니다. 이상적으로, 매트릭스는 중합을 보장하고 EB의 ECM으로 기능하기 위해 50% 이상 희석되어서는 안 됩니다. 임베딩에 실패하면 EB를 복구하고 다시 캡슐화할 수 있습니다. 신선한 매트릭스에서 재캡슐화는 오가노이드에 추가 지지를 제공하기 위해 어느 시점에서나 수행할 수 있습니다.
스캐폴딩을 위한 매트릭스 임베딩과 유사하게, PLGA 섬유는 3차원 성장을 위한 추가적인 지원을 제공한다. 본래 길쭉한 오가노이드를 생산하고표면적을 증가시키기 위해 혼입된 PLGA 섬유의 혼입은 오가노이드 분화 및 성숙을 개선하기 위한 추가적인 도구로서 점진적으로 확인되었다39. 더 많은 실험실에서 매트릭스의 사용을 줄이거나 완전히 폐지하려고 함에 따라, 통합된 섬유에 의해 지지되는 오가노이드의 자기 조직화 특성은 3차원 조직 생성 및 분화를 위한 충분한 스캐폴딩을 제공합니다39. 여기에서 두 가지 방법을 결합하여 장기 배양 기회를 높였습니다38,39. 초기 응집 동안 섬유의 통합은 나중 단계에서 도입되지 않을 수 있으므로 매우 중요합니다. 원심분리 후, 응집된 세포 사이에 몇 개의 섬유가 있는지 확인하면 섬유가 EB에 통합되는지 확인할 수 있습니다. 성공하지 못하면 우물의 부드러운 흡인과 재 원심 분리가 혼합을 보장해야합니다.
오가노이드 유지 관리의 또 다른 중요한 단계는 더 나은 매체 관류를 위한 오비탈 셰이커의 도입입니다. 오가노이드 프로토콜의 초기 반복에서, 교반을 생성하기 위해 회전하는 생물반응기가 사용되었다11. 90rpm의 오비탈 쉐이커는 매트릭스 액적을 파괴하거나 오가노이드 형태를 손상시키지 않으면서 충분한 교반을 제공합니다. 일부 그룹은 매트릭스 스캐폴드를 사용하는 것을 자제하지만 적절한 환경(34)을 제공하기 위해 쉐이커 교반을 유지한다. 모든 프로토콜과 마찬가지로 전단 응력의 양을 줄이기 위해 Shaker에 따라 회전 속도를 조정해야 합니다. 돔 임베딩이 선택되면, 전단 응력(11,34)의 양을 줄이기 위해 기울어 진 쉐이커를 사용할 수 있습니다.
종합하면, 몇 가지 선택된 기술의 통합은 iPSC 유래 오가노이드 형성의 강력한 방법을 제공합니다. 오가노이드를 만들고 유지하는 방법에는 여러 가지가 있지만 대부분은 초기 분화 궤적에 초점을 맞춥니다. 이 작업에서는 분화 단계를 지나 노화 표현형이 발달하기 시작할 수 있는 성숙 기간까지 오랜 기간 동안 오가노이드를 배양하기 위해 여러 가지 다른 기술을 결합했습니다. 이러한 기술을 통합하면 배양을 유지하기 위해 외인성 생물학적 요인 없이 성숙을 연장할 수 있어 자체 조직화와 노화의 자연스러운 진행을 유지할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 네덜란드 정부의 교육 문화 과학부가 자금을 지원하는 NWO 중력 프로젝트(024.003.001)인 네덜란드 Organ-on-Chip Initiative의 지원을 받았습니다. DCB는 박사 장학금의 형태로 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)의 재정 지원을 고맙게 인정합니다.
2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |