"केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंत माइक्रोबायोम के परिमाणीकरण और विश्लेषण के लिए फ्लो वर्मिमेट्री का अनुप्रयोग"।
Summary
केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन को चलाने वाले आणविक निर्धारकों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। एलिगेंस फिजियोलॉजी के प्रमुख पहलुओं के साथ आंत माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण के एकल पशु स्तर की रूपरेखा तैयार करने वाली एक उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
आंत माइक्रोबायोम की संरचना पूरे विकास और जानवर के जीवन में मेजबान शरीर विज्ञान पर नाटकीय प्रभाव डाल सकती है। माइक्रोबायोम में संरचनात्मक परिवर्तनों को मापना इन शारीरिक परिवर्तनों के बीच कार्यात्मक संबंधों की पहचान करने में महत्वपूर्ण है। केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन के आणविक ड्राइवरों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मेजबान प्रणाली के रूप में उभरा है। इसकी पारदर्शी शरीर योजना और फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्राकृतिक रोगाणुओं के साथ, एक व्यक्तिगत सी एलिगेंस जानवर के आंत माइक्रोबायोम के भीतर रोगाणुओं के सापेक्ष स्तर को एक बड़े कण सॉर्टर का उपयोग करके आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। यहां हम एक माइक्रोबायोम के प्रयोगात्मक सेटअप, वांछित जीवन चरण, सॉर्टर के संचालन और रखरखाव में सी एलिगेंस आबादी के संग्रह और विश्लेषण और परिणामी डेटासेट के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। एलिगेंस जीवन चरणों के लिए प्रभावी गेटिंग रणनीतियों के विकास, और आंत माइक्रोबायोम संरचना के आधार पर पशु आबादी को समृद्ध करने के लिए सॉर्टर क्षमताओं का उपयोग कैसे करें, इसके आधार पर सॉर्टर सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए विचारों पर भी चर्चा करते हैं। संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में प्रस्तुत किए जाएंगे, जिसमें उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए स्केलेबिलिटी की क्षमता शामिल है।
Introduction
पशु विकास निरंतर माइक्रोबियल प्रभाव में है1. पर्यावरण में विविध रोगाणुओं से, पशु मेजबानविशिष्ट भागीदारों 2 का अधिग्रहण करते हैं जो मेजबान की क्षमताओं का विस्तार करते हैं और इसके शरीर विज्ञान और रोग3 के लिए संवेदनशीलता को चलाते हैं। उदाहरण के लिए, आंत माइक्रोबायोम के मेटाजेनोमिक विश्लेषण ने माइक्रोबियल जीन के समृद्ध चयापचय वर्गों को उजागर किया जो मोटापे सेग्रस्त चूहों में अधिक ऊर्जा फसल और भंडारण प्रदान कर सकते हैं4, जिनमें से कई मानव आंत माइक्रोबायोम5 में भी पाए जाते हैं। अभी भी कारण संबंधों को स्थापित करने और माइक्रोबायोम प्रभाव के आणविक निर्धारकों को इंगित करने की बहुत आवश्यकता है, हालांकि माइक्रोबायोम जटिलताओं और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए मेजबान प्रणालियों की ट्रैक्टेबिलिटी से प्रगति बाधित हुई है।
एलिगेंस माइक्रोबायोम और मेजबान शरीर विज्ञान के बीच संबंधों की आणविक समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक मंच प्रदान करता है। एलिगेंस में एक म्यूकोसल परत और विली संरचनाओं के साथ 20 आंतों की कोशिकाएं होती हैं। ये कोशिकाएं प्रचुर मात्रा में केमोसेप्टर जीन से लैस होती हैं जो माइक्रोबियल उत्पादों को समझती हैं और रोगाणुरोधी अणुओं का उत्पादन करती हैं जो संभावित रूप से अपने आंत कॉलोनाइज़र 6,7 को नियंत्रित करती हैं। एलिगेंस के इस संरक्षित जीव विज्ञान ने मेजबान सिग्नलिंग में जबरदस्त संख्या में खोजों को जन्म दिया है जो इंसुलिन सिग्नलिंग, टीजीएफ-बीटा और एमएपी काइनेज 8,9,10 सहित आंत रोगाणुओं को नियंत्रित करते हैं।
एलिगेंस विकास के दौरान विकास के लिए अपने आहार और वयस्कों के रूप में माइक्रोबायोम दोनों के रूप में रोगाणुओं का उपयोग करते हैं। बुढ़ापे के साथ, कुछ रोगाणु आंत लुमेन में अधिक जमा हो सकते हैं और मेजबान-माइक्रोब संबंध सहजीवन से रोगजनन11 में बदल जाता है। अपने प्राकृतिक आवासों में, सी एलिगेंस बैक्टीरिया प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला का सामना करता है12,13. प्राकृतिक आवासों (सड़े हुए फल, पौधे के तने और पशु वैक्टर) में एकत्र किए गए प्रतिनिधि नमूनों से अनुक्रमण 16 एस आरडीएनए से पता चला है कि सी एलिगेंस के प्राकृतिक माइक्रोबायोम में चार बैक्टीरियल फ़ाइला का वर्चस्व है: प्रोटियोबैक्टीरिया, बैक्टेरोइड्स, फर्मिक्यूट्स और एक्टिनोबैक्टीरिया। इन विभाजनों के भीतर निवास स्थान12,13,14,15 के आधार पर बैक्टीरिया की विविधता और समृद्धि में बहुत भिन्नता है। कई परिभाषित समुदायों की स्थापना की गई है, जिसमें 63-सदस्यीय (BIGbiome) 16 और 12-सदस्यीय (CeMbio) संग्रह शामिल हैं जो सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय17 के लिए बनाए गए शीर्ष माइक्रोबायोम जेनेरा का प्रतिनिधित्व करते हैं। माइक्रोबायोम और घटक उपभेददोनों सी एलिगेंस के शरीर विज्ञान पर विविध प्रभाव डाल सकते हैं जैसे कि शरीर का आकार, विकास दर और तनाव प्रतिक्रियाएं 9,16,17। ये अध्ययन माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस को स्थापित करने के लिए संसाधन और उदाहरण प्रदान करते हैं।
यहां एक बड़े कण सॉर्टर (एलपीएस) आधारित वर्कफ़्लो (चित्रा 1) प्रस्तुत किया गया है जो जनसंख्या पैमाने पर माइक्रोबायोम संरचना और मेजबान शरीर विज्ञान के बुनियादी उपायों को एक साथ मापने के लिए सी एलिगेंस सिस्टम का उपयोग करता है। माइक्रोबियल पक्ष से, वर्कफ़्लो बढ़ते माइक्रोबियल इंटरैक्शन के साथ समुदाय की मजबूती और प्लास्टिसिटी का परीक्षण करने के लिए एक परिभाषित माइक्रोबायोम या एकल रोगाणुओं को इकट्ठा करने के लिए अनुकूलनीय है। मेजबान पक्ष से, वर्कफ़्लो माइक्रोबायोम में फ्लोरोसेंट रोगाणुओं के उपनिवेशस्तर को मापने और विकास, शरीर के आकार और प्रजनन के संदर्भ में मेजबान शारीरिक रीडआउट को मापने के लिए उच्च थ्रूपुट परख को सक्षम बनाता है। एलिगेंस माइक्रोबायोम मॉडल उच्च थ्रूपुट स्क्रीन को मेजबान शरीर विज्ञान को संशोधित करने वाले चयापचय और आनुवंशिक निर्धारकों को इंगित करने में सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
फ्लो वर्मिमेट्री का उपयोग कईअध्ययनों में रोगज़नक़ उपनिवेशीकरण और विषाक्तता के खिलाफ सी एलिगेंस जीन और मार्गों को चिह्नित करने के लिए किया गया है। यहां, एक उच्च थ्रूपुट उत्त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान DP2DK116645 (बीएसएस को), डन फाउंडेशन पायलट अवार्ड और नासा अनुदान 80एनएसएससी 22के0250 (बीएसएस को) द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना को बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसमें सीपीआरआईटी कोर सुविधा समर्थन पुरस्कार (सीपीआरआईटी -RP180672), एनआईएच (एस 10 OD025251, CA125123 और RR024574) और जोएल एम सेडरस्ट्रॉम की सहायता से एलपीएस एनआईएच अनुदान (एस 10 OD025251) के लिए एक इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान शामिल था। कुछ उपभेदों को सीजीसी द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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