Denne protokol beskriver en metode til indsamling af tåreprøver ved hjælp af Schirmer-strimler og en integreret kvantitativ arbejdsgang til opdagelse af ikke-invasive tåreproteinbiomarkører. Arbejdsgangen til forberedelse af suspensionsfangstprøver muliggør hurtig og robust forberedelse af tåreprøver og massespektrometrisk analyse, hvilket resulterer i højere peptidgenvindingsudbytter og proteinidentifikation end standardprocedurer i opløsningen.
Tårevæske er en af de let tilgængelige biofluider, der kan opsamles ikke-invasivt. Tåreproteomics har potentialet til at opdage biomarkører for flere okulære sygdomme og tilstande. Det er rapporteret, at suspensionsfældekolonnen er en effektiv og brugervenlig arbejdsgang til prøveforberedelse til bred anvendelse af proteomisk analyse nedstrøms. Alligevel er denne strategi ikke blevet godt undersøgt i analysen af humant tåreproteom. Denne protokol beskriver en integreret arbejdsgang fra kliniske humane tåreprøver til oprensede peptider til ikke-invasiv tåreproteinbiomarkørforskning ved hjælp af massespektrometri, som giver indsigt i sygdomsbiomarkører og overvågning, når de kombineres med bioinformatikanalyse. En proteinsuspensionsfangeprøveforberedelse blev anvendt og demonstrerede opdagelsen af tåreproteom med hurtige, reproducerbare og brugervenlige procedurer som en universel, optimeret prøveforberedelse til human tårevæskeanalyse. Især suspensionsfangstproceduren overgik prøveforberedelse i opløsning med hensyn til peptidgenvinding, proteinidentifikation og kortere prøveforberedelsestid.
Tear proteomics har fået opmærksomhed på at udforske potentielle biomarkører for okulære sygdomme og tilstande 1,2,3,4,5,6, for at få adgang til patogenesen af den okulære og systemiske tilstand samt at udnytte fordelen ved ikke-invasiv tåreprøveindsamling ved hjælp af Schirmer-strimler. Den teknologiske udvikling af næste generations massespektrometri har muliggjort proteinkvantificering i mikroliterskala tårer med nøjagtighed og præcision, der ikke tidligere har været mulig. Prøveforberedelsesmetoder er endnu ikke standardiserede. En robust og standardiseret arbejdsgang til prøveforberedelse er afgørende for succesen med klinisk anvendelse i tåreproteinbiomarkørforskning. Suspensionsfældefangst (S-Trap) prøveforberedelsesarbejdsgang blev for nylig rapporteret som en effektiv og følsom prøveforberedelsesmetode til bred nedstrøms proteomisk analyse 7,8. Alligevel er denne strategi ikke blevet godt rapporteret i analysen af humant tåreproteom, udkonkurreret filterstøttet prøveforberedelse (FASP) og fordøjelse i opløsning med hensyn til enzymatisk nedbrydningseffektivitet og det større antal proteinidentifikation ved massespektrometrisk analyse9. Den S-Trap-baserede tilgang blev demonstreret i fremstillingen af retinal væv 10, formalinfikseret, paraffinindlejret (FFPE) væv11, celler 12, mikroorganisme 13 og flydende biopsier14,15.
Denne protokol beskriver en integreret kvantitativ arbejdsgang fra kliniske prøver til enzymatisk fordøjet protein til opdagelsen af et ikke-invasivt tåreproteinbiomarkørpanel med en hurtig, reproducerbar og robust teknisk strategi. Kort fortalt blev tårevæske opsamlet ved hjælp af en standard Schirmer-strimmel og straks tørret med en oftalmisk rammevarmer for at forhindre proteinautolyse ved stuetemperatur. Indlejrede totalproteiner blev ekstraheret under anvendelse af 5% natriumdodecylsulfat (SDS) lysisbuffer i henhold til producentens forslag efterfulgt af proteinanalysemåling. Det ekstraherede lysat gennemgik derefter standardreduktion med dithiothreitol (DTT) og alkylering med iodoacetamid (IAS).
Efter syring med phosphorsyre blev suspensionsfangekolonneproteinudfældningsbuffer indeholdende 90% methanol og 100 mM triethylammoniumbicarbonat (TEAB) tilsat til samlede proteiner. Prøven blev derefter overført til en ny suspensionsfældende mikrokolonne. Enzymatisk fordøjelse med udført med sekventering grade trypsin i forholdet 1:25 (w/w, trypsin: protein) ved 47 °C i 1 time. De resulterende peptider blev derefter elueret via centrifugering, sekventielt med 50 mM TEAB, 0,2% vandig myresyre (FA) og 50% acetonitril (ACN) indeholdende 0,2% FA. De eluerede peptider blev vakuumtørret og rekonstitueret i 0,1 % FA. Peptidkoncentrationen blev målt og justeret til 0,5 μg/μL til massespektrometrisk analyse.
For at opnå nøjagtige resultater ved hjælp af denne metode skal der bæres strømfrie engangshandsker i alle procedurer fra indsamling af riveprøver for at undgå prøvekontaminering. Det er vigtigt at undgå bobler og luftspalter mellem filteret og prøveopløsningen i hvert trin ved at bruge mikrospindesøjler. Hvis prøvevolumenet er større end kolonnernes kapacitet, anbefales det at gentage processen. Denne protokol har vist sig at være mere effektiv end den traditionelle protokol i opløsningen med hensyn til forberedelsestid, proteingenvinding og total proteinidentifikation. Dette skyldes hovedsageligt, at prøverne gennemgår de fleste af de krævede procedurer i samme kolonne, i modsætning til metoden i opløsning, der involverer flere overførselstrin såsom acetoneudfældning, fordøjelse og oprydning (afsaltning), hvilket øger sandsynligheden for variationer i de resulterende data.
Ud over de tåreprøver, der indsamles med mikrokapillærmetoden16,17, giver denne FASP-arbejdsgang med suspensionsfangende mikrokolonne en alternativ prøveforberedelsesmetode, der muliggør hurtig og robust forberedelse af tåreprøver indsamlet ved hjælp af Schirmer-strimler med minimal materialeforberedelse og brugervenlige trin at følge. Dette muliggør reproducerbar forberedelse af tåreprøver til store kohorteundersøgelser på tværs af flere okulære sygdomme eller tilstande med forbedret peptidgenvinding og proteinidentifikation af MS over procedurer i opløsning. Denne pålidelige proces kan anvendes regelmæssigt til fremstilling af tårebiomarkørprøver til forskning og andre kliniske formål. Vigtigst af alt kræver det minimal personaleuddannelse til indsamling på stedet og ophæver behovet for prøveopbevaring i en fryser. Prøver tørres på stedet for at minimere proteinautolyse og nedbrydning. Derfor muliggør dette bekvem forsendelse via post for at lette downstream-analyse i modsætning til at bruge mikrokapillarrør.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af InnoHK-initiativet og Hongkongs særlige administrative region. Forskningscenter for SHARP Vision; og Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI) ved Hong Kong Polytechnic University.
9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |