वास्तविक समय शून्य स्पॉट परख
Summary
यह आलेख पारंपरिक शून्य स्पॉट परख में वीडियो निगरानी को शामिल करके माउस शून्यव्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान शून्यता की घटनाओं और माउस व्यवहार के विवरण पर लौकिक, स्थानिक और वॉल्यूमेट्रिक जानकारी प्रदान करता है।
Abstract
सामान्य शून्यता व्यवहार तंत्रिका तंत्र के उचित नियंत्रण के तहत मूत्राशय, मूत्रमार्ग और मूत्रमार्ग स्फिंक्टर्स के समन्वित कार्य का परिणाम है। माउस मॉडल में स्वैच्छिक शून्यता व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने शून्य स्पॉट परख (वीएसए) विकसित की है, एक विधि जो एक जानवर के पिंजरे के फर्श को अस्तर करने वाले फिल्टर पेपर पर जमा मूत्र के धब्बे की संख्या और क्षेत्र को मापती है। हालांकि तकनीकी रूप से सरल और सस्ती, इस परख की सीमाएं हैं जब अंत-बिंदु परख के रूप में उपयोग किया जाता है, जिसमें शून्यता की घटनाओं के अस्थायी समाधान की कमी और अतिव्यापी मूत्र धब्बे को निर्धारित करने में कठिनाइयां शामिल हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने एक वीडियो-मॉनिटर वीएसए विकसित किया, जिसे हम वास्तविक समय वीएसए (आरटी-वीएसए) कहते हैं, और जो हमें शून्यता आवृत्ति निर्धारित करने, शून्य मात्रा और शून्यपैटर्न का आकलन करने और दिन के अंधेरे और प्रकाश दोनों चरणों के दौरान 6 घंटे की समय खिड़कियों पर माप करने की अनुमति देता है। इस रिपोर्ट में वर्णित विधि को माउस-आधारित अध्ययनों की एक विस्तृत विविधता पर लागू किया जा सकता है जो स्वास्थ्य और रोग राज्यों में स्वैच्छिक माइक्रोट्यूरिटेशन के शारीरिक और न्यूरोबिहेवियरल पहलुओं का पता लगाते हैं।
Introduction
मूत्र भंडारण और अभ्रक को एक केंद्रीय सर्किटरी (केंद्रीय तंत्रिका तंत्र) द्वारा समन्वित किया जाता है जो श्रोणि और हाइपोगैस्ट्रिक नसों के माध्यम से मूत्राशय भरने की स्थिति के बारे में जानकारी प्राप्त करता है। यूरोथेलियम, एपिथेलियम जो गुर्दे की श्रोणि से समीपस्थ मूत्रमार्ग तक मूत्र पथ को रेखाबद्ध करता है, मूत्र में मौजूद चयापचय अपशिष्ट उत्पादों और रोगजनकों के लिए एक तंग बाधा बनाता है। यह एक संवेदी वेब का एक अभिन्न घटक है, जो मूत्राशय की भरने की स्थिति को अंतर्निहित ऊतकों और अभिवाही तंत्रिकाओं 1,2 को महसूस करता है और संचारकरता है। यूरोथेलियल बाधा का विघटन, या यूरोथेलियल मेकेनोट्रांसडक्शन मार्गों में परिवर्तन, कम मूत्र पथ के लक्षणों जैसे आवृत्ति, तात्कालिकता, नोक्टुरिया और असंयम 3,4,5,6,7 के साथ शून्यता का कारण बन सकता है। इसी तरह, उम्र बढ़ने, मधुमेह, कम मूत्र पथ के संक्रमण, अंतरालीय सिस्टिटिस, और अन्य रोग प्रक्रियाएं जो मूत्राशय को प्रभावित करती हैं, या संबंधित सर्किटरी जो इसके कार्य को नियंत्रित करती हैं, मूत्राशय की शिथिलता 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 के कारण जानी जाती हैं। 18,19. सामान्य और असामान्य शून्यता व्यवहार की बेहतर समझ उन तरीकों के विकास पर निर्भर करती है जो विभिन्न पेशाब पैटर्न के बीच मज़बूती से भेदभाव कर सकते हैं।
परंपरागत रूप से, चूहों के स्वैच्छिक शून्यीकरण व्यवहार का अध्ययन शून्य स्पॉट परख (वीएसए) का उपयोग करके किया गया है, जिसे डेस्जार्डिंस और सहयोगियों 20 द्वारा विकसित किया गया है, और मोटे तौर पर इसकी सादगी, कम लागत और गैर-आक्रामक दृष्टिकोण 8,21,22,23,24 के कारण अपनाया गया है। यह परख आम तौर पर एक समापन बिंदु परख के रूप में किया जाता है, जिसमें एक माउस एक फिल्टर पेपर द्वारा पंक्तिबद्ध पिंजरे में एक निर्धारित समय बिताता है, जिसे बाद में संख्या की गणना करके और मूत्र के धब्बों के आकार का आकलन करके विश्लेषण किया जाता है जब फिल्टर पेपर को पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत रखा जाता है (इन स्थितियों के तहत मूत्र के धब्बे फ्लोरेस)20।. इन कई फायदों के बावजूद, पारंपरिक वीएसए कुछ प्रमुख सीमाएं प्रस्तुत करता है। क्योंकि चूहे अक्सर एक ही क्षेत्र में पेशाब करते हैं, जांचकर्ताओं को परख की अवधि को अपेक्षाकृत कम समय (≤4 घंटे) 25 तक सीमित करना पड़ता है। यहां तक कि जब वीएसए को कम समय अवधि में किया जाता है, तो छोटे शून्य धब्बे (एसवीएस) को हल करना लगभग असंभव होता है जो बड़े शून्य धब्बे पर गिरते हैं या, पूंछ या पंजे से चिपके मूत्र के कैरीओवर से एसवीएस को अलग करना। यह भेद करना भी बहुत मुश्किल है कि क्या एसवीएस लगातार लेकिन व्यक्तिगत शून्यता की घटनाओं का परिणाम है (एक फेनोटाइप जो अक्सर सिस्टिटिस 4,26 के जवाब में देखा जाता है), या पोस्ट-माइक्रोट्यूरियन ड्रिबलिंग (मूत्राशय आउटलेट रुकावट 27 से जुड़ा एक फेनोटाइप) के कारण। इसके अलावा, काम के घंटों के दौरान परख को पूरा करने की इच्छा, रोशनी बंद होने पर आवास सुविधाओं तक पहुंचने में कठिनाइयों के साथ मिलकर, अक्सर इन परखों को 24 घंटे के सर्कैडियन चक्र की प्रकाश अवधि तक सीमित कर देती है। इस प्रकार, ये समय की बाधाएं अपने सक्रिय रात के चरण के दौरान माउस शून्यव्यवहार के मूल्यांकन को रोकती हैं, जिससे सर्कैडियन लय द्वारा नियंत्रित विशिष्ट जीन या उपचार का विश्लेषण करने की क्षमता कम हो जाती है।
इन सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने वास्तविक समय 26,28,29,30,31,32 में शून्यता व्यवहार का आकलन करने के लिए वैकल्पिक तरीके विकसित किए हैं। इनमें से कुछ दृष्टिकोणों में चयापचय पिंजरों26,28,29, या थर्मल कैमरों30 के उपयोग जैसे महंगे उपकरणों का उपयोग शामिल है; हालांकि, इनकी भी सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, चयापचय पिंजरों में, मूत्र जाल फर्श के तारों और फ़नल की दीवारों का पालन करता है, जिससे एकत्र और मापा जाने वाले मूत्र की मात्रा कम हो जाती है। इस प्रकार, छोटी रिक्तियों के बारे में सटीक रूप से डेटा एकत्र करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, चयापचय पिंजरे शून्यता की घटनाओं के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं (यानी, कोनों में पेशाब बनाम कक्ष के केंद्र)। यह देखते हुए कि थर्मोग्राफिक कैमरों द्वारा उपयोग किए जाने वाले लंबी-तरंग दैर्ध्य अवरक्त विकिरण ठोस पदार्थों में प्रवेश नहीं करते हैं, वीडियो थर्मोग्राफी द्वारा मूल्यांकन की गई शून्यता गतिविधि को एक खुली प्रणाली में किया जाना चाहिए, जो सक्रिय चूहों के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि वे हवा में कई इंच कूद सकते हैं। एक अन्य प्रणाली कागज पर स्वचालित शून्य दाग (एवीएसओपी) दृष्टिकोण33 है, जिसमें रोल्ड फिल्टर पेपर होता है जो माउस पिंजरे के तार जाल फर्श के नीचे निरंतर गति से चलता है। यह दृष्टिकोण शास्त्रीय वीएसए में होने वाले पेपर क्षति और मूत्र के धब्बे के ओवरलैप को रोकता है, और इसका कार्यान्वयन अन्वेषक को कई दिनों तक प्रयोग करने की अनुमति देता है। हालांकि, यह अन्वेषक को शून्य घटनाओं के सटीक समय के साथ प्रदान नहीं करता है, और व्यवहार की जांच करने की कोई क्षमता नहीं है और यह स्पॉटिंग के साथ कैसे संबंधित है। इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं ने वीडियो-मॉनिटरिंग को शून्य करने के लिए शामिल किया है, एक दृष्टिकोण जो माउस गतिविधि और पेशाब की घटनाओं31,32 के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है। एक दृष्टिकोण में एक ब्लू लाइट एमिटिंग डायोड (एलईडी) और एक वीडियो-कैमरा रखा जाता है, जिसमें एक हरे रंग की प्रतिदीप्ति प्रोटीन फिल्टर होता है जो शून्यता की घटनाओं की कल्पना करने के लिए प्रयोगात्मक पिंजरे के नीचे सेट होता है, और माउस की स्थितिको कैप्चर करने के लिए पिंजरे के ऊपर एक इन्फ्रारेड एलईडी और एक वीडियो-कैमरा होता है। इस सेटअप का उपयोग फाइबर फोटोमेट्री करते समय शून्यता व्यवहार की निगरानी के लिए किया गया है; हालांकि, इस प्रणाली के उज्ज्वल रोशनी वाले वातावरण में जांचकर्ताओं को शून्यता को प्रोत्साहित करने के लिए मूत्रवर्धक एजेंट के साथ अपने चूहों का इलाज करने की आवश्यकता थी। एक अन्य प्रयोगात्मक डिजाइन में, क्रमशः माउस मोटर गतिविधि और पेशाब की घटनाओं की कल्पना करने के लिए प्रयोगात्मक पिंजरे के ऊपर और नीचे वाइड-एंगल कैमरे रखे गए थे। इस मामले में, पिंजरे के फर्श को अस्तर करने वाले फिल्टर पेपर पर जमा मूत्र के धब्बे पिंजरे31 के नीचे रखी यूवी रोशनी के साथ फिल्टर पेपर को रोशन करके प्रकट किए गए थे। इस सेटअप का उपयोग स्वैच्छिक शून्यीकरणव्यवहार में शामिल ब्रेनस्टेम न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए दिन के प्रकाश चरण के दौरान 4 मिनट की अवधि में किया गया था। अंधेरे चरण के दौरान या समय की अवधि >4 मिनट के लिए इसके उपयोग के लिए इस प्रणाली की उपयुक्तता की सूचना नहीं दी गई थी।
इस लेख में, एक विधि का वर्णन किया गया है जो माउस शून्यव्यवहार की दीर्घकालिक वीडियो निगरानी की अनुमति देकर पारंपरिक वीएसए को बढ़ाता है। यह लागत प्रभावी दृष्टिकोण माउस व्यवहार 3,4,34 से संबंधित विवरण के साथ-साथ दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान विस्तारित अवधि के लिए शून्यता की घटनाओं के बारे में लौकिक, स्थानिक और वॉल्यूमेट्रिक जानकारी प्रदान करता है। शून्यीकरण कक्षों के निर्माण, वास्तविक समय वीएसए (आरटी-वीएसए) के कार्यान्वयन और डेटा के विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान की गई है। आरटी-वीएसए उन शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान है जो शारीरिक तंत्र को समझने की मांग करते हैं जो मूत्र प्रणाली के कार्य को नियंत्रित करते हैं, माइक्रोट्यूरियन को नियंत्रित करने के लिए औषधीय दृष्टिकोण विकसित करते हैं, और रोग प्रक्रियाओं के आणविक आधार को परिभाषित करते हैं जो निचले मूत्र पथ को प्रभावित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वीडियो-निगरानी का समावेश एक लागत प्रभावी संशोधन है जो शास्त्रीय वीएसए पर कई फायदे प्रस्तुत करता है। शास्त्रीय वीएसए में, जिसे आमतौर पर अंत-बिंदु परख के रूप में उपयोग किया जाता है, अतिव्यापी शून्य धब्ब?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान R01DK119183 (जीए और एमडीसी को), P30DK079307 के माध्यम से एक पायलट प्रोजेक्ट अवार्ड (एमजीडी को), एक अमेरिकन यूरोलॉजी एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड और विंटर्स फाउंडेशन अनुदान (एनएम को), और पिट्सबर्ग सेंटर फॉर किडनी रिसर्च (P30DK079307) के सेल फिजियोलॉजी और मॉडल ऑर्गेनिज्म किडनी इमेजिंग कोर द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
References
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