Begrænsning af tidspunktet for fødeindtagelse har vist sig at være en lovende intervention for at dæmpe diætinducerede metaboliske sygdomme. Dette manuskript beskriver konstruktionen og brugen af et effektivt system indbygget internt til måling og manipulation af rytmisk fødeindtagelse hos mus.
Rytmisk genekspression er et kendetegn ved døgnrytmen og er afgørende for at drive rytmiciteten af biologiske funktioner på det rette tidspunkt på dagen. Undersøgelser i løbet af de sidste par årtier har vist, at rytmisk fødeindtagelse (dvs. det tidspunkt, hvor organismer spiser mad i løbet af 24 timers dagen) bidrager væsentligt til den rytmiske regulering af genekspression i forskellige organer og væv i hele kroppen. Virkningerne af rytmisk fødeindtagelse på sundhed og fysiologi er blevet bredt undersøgt lige siden og har afsløret, at begrænsning af fødeindtagelse i 8 timer i den aktive fase dæmper metaboliske sygdomme, der stammer fra en række overvægtige kostvaner. Disse undersøgelser kræver ofte anvendelse af kontrollerede metoder til timing af levering af mad til dyr. Dette manuskript beskriver design og brug af et billigt og effektivt system, bygget internt til måling af det daglige fødeindtag samt manipulation af rytmisk fødeindtagelse hos mus. Dette system indebærer brug af råvarer til overkommelige priser til at bygge bure, der er egnede til levering af fødevarer, efter en brugervenlig håndteringsprocedure. Dette system kan bruges effektivt til at fodre mus på forskellige fodringsregimer såsom ad libitum, tidsbegrænsede eller arytmiske tidsplaner og kan inkorporere en fedtfattig diæt for at studere dens virkning på adfærd, fysiologi og fedme. Der gives en beskrivelse af, hvordan vildtypemus (WT) tilpasser sig de forskellige fodringsregimer.
Det cirkadiske ur findes allestedsnærværende på tværs af arter og giver en tidsregistreringsmekanisme, der hjælper organismer med at tilpasse sig deres rytmisk skiftende miljø. Master cirkadiske pacemaker er placeret i den suprachiasmatiske kerne (SCN) af hypothalamus. SCN er primært indlejret af den miljømæssige lys-mørke cyklus og synkroniserer perifere ure, der findes i næsten alle celler i kroppen via flere signaler, herunder neuronale og hormonelle signaler, fodring og kropstemperatur 1,2,3,4,5,6,7,8 . Hos pattedyr er det molekylære cirkadiske ur afhængig af den heterodimeriske transkriptionsfaktor CLOCK: BMAL1 9,10, som styrer ekspressionen af kerneurgenerne ved navn Period (Per1, Per2 og Per3) og Cryptochrome (Cry1 og Cry2) for at starte en transkriptionel feedback-sløjfe, der er kritisk for dannelsen af cirkadiske rytmer 9,11,12 . Det molekylære ur regulerer også den rytmiske transkription af tusindvis af gener, der styrer rytmiciteten af stort set alle biologiske funktioner13,14,15. Mere end 50% af genomet hos pattedyr udtrykkes rytmisk i mindst en vævstype 16,17,18, og væv som leveren hos mus har ca. 25% -30% af deres transkriptom udtrykt rytmisk18,19. Rytmisk genekspression er afgørende for at aktivere vigtige biologiske processer såsom cellecykluskontrol20, glukosehomeostase 21 og aminosyremetabolisme22 på det rigtige tidspunkt på dagen for at øge organismens kondition.
I løbet af de sidste par årtier har der været stigende beviser, der tyder på, at fødeindtagelse kan fungere som et potent synkroniserende signal til at inddrage rytmer i genekspression i flere væv, herunder leveren23,24. Det er vigtigt, at fodring har vist sig at inddrage rytmer i leveren uafhængigt af SCN eller af den lys-mørke cyklus25, og rytmisk fodring kan drive rytmisk genekspression uden at involvere molekyluret 26,27,28,29,30,31. Fodring begrænset til musens inaktive periode (dagtimerne) vender ekspressionsfasen af kerneurgenerne og af mange rytmiske gener31. Tidsbegrænset fodring (TRF), som er en ernæringsmæssig intervention, hvor det daglige kalorieindtag er begrænset til en periode på 8-10 timer, har vist sig at beskytte mod fedme, hyperinsulinæmi, hepatisk steatose og metabolisk syndrom32,33. Alle ovennævnte eksperimenter, der involverer manipulation af fødeindtagelse, kræver, at eksperimentatoren bruger effektive metoder til at levere mad på det rigtige tidspunkt på dagen.
Der er udviklet forskellige metoder til levering af fødevarer, som har flere fordele og ulemper 29,34,35,36,37,38,39 (tabel 1). Nogle automatiserede foderautomater er designet til at fungere baseret på en software, der styrer mængden, varigheden og timingen af fødetilgængelighed, mens de registrerer fodring og frivillig hjulløbsaktivitet hos mus34. Et par andre metoder involverer mus, der placeres i forskellige bure til forskellige fodringsforhold, hvor eksperimentatoren manuelt tilføjer madpiller på forudsætningstidspunktet38,39. Et andet system anvender et automatiseret fødesystem, der styres af en computer, hvor et pneumatisk drevet skjold forhindrer adgang til fødevarer, og som kan styres enten ved tidsintervaller eller fødemasse35. Alle disse metoder kræver enten udnyttelse og opsætning af en edb-software, der kan være dyr og kræve en vis træning for korrekt betjening af instrumentet eller er arbejdskrævende, fordi eksperimentatoren skal være til stede på bestemte tidspunkter for manuelt at ændre fodringsforholdene. Computeriserede systemer kommer også med deres andel af problemer, herunder funktionsfejl i håndtag eller døre, der slipper maden ud, madpiller, der sidder fast i stikkontakterne og softwarenedbrud. Desuden udgør den lyd, der kan frembringes under åbning af døre eller håndtag, en risiko for, at mus konditioneres til at forbinde disse med madlevering, hvorved fortolkningen af virkningerne af fødevaremanipulation udelukkende skyldes adgang til mad eller på grund af virkninger på andre adfærdsrytmer såsom søvn/vågen-cyklus. Det overordnede mål med denne undersøgelse var at udvikle et overkommeligt og effektivt system til at manipulere langsigtet rytmisk fødeindtagelse, der ville hjælpe med at lindre mange af disse førnævnte problemer. Først og fremmest kan det fremføringsapparat, der blev udviklet og beskrives nedenfor, konstrueres til en meget minimal pris sammenlignet med de automatiserede maskiner (tabel 2) og kræver ikke sofistikeret træning til håndtering, drift og vedligeholdelse. For det andet producerer fodringssystemet kun en baggrundshvid støj og ingen høje lyde under madlevering, hvilket forhindrer Pavlovian konditionering. Alt i alt er dette fodringssystem økonomisk, mere tilgængeligt og pålideligt for forskere, mens det stadig er effektivt til manipulation af rytmisk fødeindtagelse.
Omfattende forskning er blevet udført i løbet af de sidste par årtier om manipulation af fodringsrytmer og deres virkning på fysiologi. Konstruktionen og udnyttelsen af det her beskrevne fodringssystem kan bruges som en effektiv metode til manipulation af fødeindtagelse. Protokollen bruger en fælles 24 timers timer og en madkop designet som en otte-rums arrangør som nøglekomponenter i systemet. Burene kan nemt konstrueres ved hjælp af nogle få lettilgængelige værktøjer, og håndteringen af systemet er brugervenlig. Nogle af de vigtigste aspekter af protokollen til tilpasning af systemet til at manipulere rytmisk fødeindtagelse inkluderer daglig skift af madkopper, da timeren vender over en 24 timers periode, manuel tælling eller vejning af resterende mad og daglig justering af antallet af pellets til AR-fodring. Typisk ses plastspåner, når mus er sultne og ikke får tilstrækkelig mad. Dette problem kan løses ved at tilføje et par flere madpiller, der overholder fodringsregimet, indtil der ikke ses plastspåner. I tilfælde af AR-fodring, hvor den daglige mad skal justeres, skal man passe på ikke at fremkalde rytmen i fødeindtagelsen (figur 3B). Derfor foretrækkes det enten at tilføje eller trække pellets i modsatte rum overalt for at holde mus arytmisk fodret.
Dette system kan forbedres yderligere ved at belægge madkopperne med et lag epoxy for at forhindre musene i at bide i plastikken og dermed hjælpe med at forlænge madkoppernes levetid. Timerens overflade til placering af madkopper kan også ændres for at hjælpe madkoppen med at sidde fladt og stabilt på timeren. Dette kan forhindre utilsigtet stop af timeren forårsaget af en ujævnt placeret timer. Et par af burkomponenterne, såsom madkopper, kan også 3D-printes for at reducere omkostningerne og specialfremstilles efter forskerens smag. Dette kan omfatte madkopper med mere end otte rum, hvilket kan give en bedre tidsopløsning end det nuværende 3 timers vindue.
Selvom det er meget effektivt, har dette system nogle begrænsninger, såsom at være arbejdskrævende, hvor forskeren stadig skal skifte madkopper hver 24. time og kræve, at de manuelt tæller / vejer den resterende mad. Derudover skal timere overvåges fra tid til anden for at identificere potentielle problemer og / eller hvis de stoppede med at arbejde. Dette kan opnås, mens man tæller de madpiller, der er tilbage efter fodring (f.eks. ved at bestemme, om nogle mus kun spiste mad i nogle få rum og efterlod nogle rum uberørte). En anden begrænsning af dette system er, at det måske ikke fungerer så godt med hunmus, da de få eksperimenter udført med hunner viste, at de har tendens til at hamstre mad og tygge plasten mere end hanmus.
Ikke desto mindre er dette fodringssystem meget effektivt til at manipulere fødeindtagelse, er let at konstruere, betjene, vedligeholde og er billigt sammenlignet med de dyre automatiserede feedere, der findes på markedet. Det kan let tilpasses og ændres, så det passer til forskerens krav og behøver ingen særlig træning for at betjene systemet. Det er vigtigt, at timere kun producerer en lav mængde konstant hvid støj, hvilket forhindrer mus i at forbinde enhver lyd med fødetilgængelighed.
Sammenfattende beskriver dette papir et innovativt fodringssystem, der kan bruges til at overvåge det daglige fødeforbrug hos mus og kan tilpasses til at fodre mus på forskellige paradigmer såsom tidsbegrænset fodring, arytmisk fodring og fodring med fedtrig kost. Dette system tilføjer til listen over værktøjer, der kan bruges til at løse vigtige spørgsmål inden for rytmisk fødeindtagelse og dens virkning på fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet økonomisk af bevillingen R01DK128133 fra NIH/NIDDK (til J.S.M) og opstartsmidler fra Texas A&M University.
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) | Everbilt | #800172 | |
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) | Everbilt | #801622 | |
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) | USPlastic | #45088 | |
4 inch PVC pipe (10 ft) | Home Depot | #531103 | |
45 mg dustless precision pellets | Bio-Serv | #F0165 | |
6 ft. Extension Cord | HDX | HD#145-017 | |
Food container (eight-compartment jewelry organizer) | JewelrySupply | #PB8301 | |
Indoor Basic Timer | General Electric | #15119 | |
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout | Home Depot | #39103D | |
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) | Research Diets | #D12451 |