Att begränsa tidpunkten för matintag har framkommit som ett lovande ingrepp för att dämpa dietinducerade metaboliska sjukdomar. Detta manuskript beskriver konstruktionen och användningen av ett effektivt system byggt internt för att mäta och manipulera rytmiskt matintag hos möss.
Rytmiskt genuttryck är ett kännetecken för dygnsrytmen och är avgörande för att driva rytmiciteten hos biologiska funktioner vid lämplig tidpunkt på dagen. Studier under de senaste decennierna har visat att rytmiskt matintag (dvs den tid då organismer äter mat under 24 timmar) väsentligt bidrar till rytmisk reglering av genuttryck i olika organ och vävnader i hela kroppen. Effekterna av rytmiskt matintag på hälsa och fysiologi har studerats allmänt sedan dess och har visat att begränsning av matintag i 8 timmar under den aktiva fasen dämpar metaboliska sjukdomar som härrör från en mängd olika obesogena dieter. Dessa studier kräver ofta användning av kontrollerade metoder för att tajma leveransen av mat till djur. Detta manuskript beskriver utformningen och användningen av ett billigt och effektivt system, byggt internt för att mäta daglig matkonsumtion samt manipulera rytmiskt matintag hos möss. Detta system innebär användning av prisvärda råvaror för att bygga burar som är lämpade för matleverans, enligt ett användarvänligt hanteringsförfarande. Detta system kan användas effektivt för att mata möss på olika utfodringsregimer såsom ad libitum, tidsbegränsade eller arytmiska scheman och kan innehålla en fettrik diet för att studera dess effekt på beteende, fysiologi och fetma. En beskrivning av hur möss av vildtyp (WT) anpassar sig till de olika utfodringsregimerna tillhandahålls.
Den cirkadiska klockan finns överallt över arter och ger en tidshållningsmekanism som hjälper organismer att anpassa sig till sin rytmiskt föränderliga miljö. Master cirkadiska pacemakern är belägen i hypotalamus suprachiasmatiska kärna (SCN). SCN är främst innesluten av den miljömässiga ljus-mörka cykeln och synkroniserar perifera klockor som finns i nästan varje cell i kroppen via flera signaler, inklusive neuronala och hormonella signaler, matning och kroppstemperatur 1,2,3,4,5,6,7,8 . Hos däggdjur förlitar sig den molekylära cirkadiska klockan på den heterodimera transkriptionsfaktorn CLOCK: BMAL1 9,10, som styr uttrycket av kärnklockgenerna som heter Period (Per1, Per2 och Per3) och Cryptochrome (Cry1 och Cry2) för att initiera en transkriptionell återkopplingsslinga som är kritisk för generering av cirkadiska rytmer 9,11,12 . Den molekylära klockan reglerar också den rytmiska transkriptionen av tusentals gener som styr rytmiciteten hos praktiskt taget alla biologiska funktioner13,14,15. Mer än 50% av genomet hos däggdjur uttrycks rytmiskt i minst en vävnadstyp 16,17,18, och vävnader som levern hos möss har cirka 25% -30% av deras transkriptom uttryckt rytmiskt 18,19. Rytmiskt genuttryck är avgörande för att aktivera viktiga biologiska processer som cellcykelkontroll20, glukoshomeostas 21 och aminosyrametabolism22 vid rätt tidpunkt på dagen för att öka organismens kondition.
Under de senaste decennierna har det ökat bevis som tyder på att matintag kan fungera som en potent synkroniseringssignal för att träna rytmer i genuttryck i flera vävnader, inklusive levern23,24. Viktigt är att utfodring har visat sig omfatta rytmer i levern oberoende av SCN eller den ljus-mörka cykeln25, och rytmisk utfodring kan driva rytmiskt genuttryck utan att involvera molekylklockan 26,27,28,29,30,31. Utfodring begränsad till den inaktiva perioden av möss (dagtid) inverterar uttrycksfasen för kärnklockgenerna och många rytmiska gener31. Tidsbegränsad utfodring (TRF), som är en näringsintervention där det dagliga kaloriintaget är begränsat till en period av 8-10 timmar, har visat sig skydda mot fetma, hyperinsulinemi, leverstatos och metaboliskt syndrom32,33. Alla ovanstående experiment som involverar manipulation av matintag kräver att experimenten använder effektiva metoder för att leverera mat vid rätt tidpunkt på dagen.
Olika metoder för matleverans har utvecklats, med flera fördelar och nackdelar 29,34,35,36,37,38,39 (tabell 1). Vissa automatiserade matare har utformats för att fungera baserat på en programvara som styr mängden, varaktigheten och tidpunkten för tillgången på mat medan du registrerar utfodring och frivillig hjulkörning hos möss34. Några andra metoder innebär att möss placeras i olika burar för olika utfodringsförhållanden, där experimentet manuellt lägger till matpellets vid förutsättningstiden38,39. Ett annat system använder ett automatiserat matarsystem som styrs av en dator där en pneumatiskt driven sköld förhindrar tillgång till mat och som kan styras antingen av tidsintervall eller massa av mat35. Alla dessa metoder kräver antingen användning och installation av en datoriserad programvara som kan vara dyr och kräver viss utbildning för korrekt drift av instrumentet eller är arbetsintensiva eftersom experimenten måste vara närvarande vid specifika tidpunkter för att manuellt ändra matningsförhållandena. Datoriserade system kommer också med sin andel av problem, inklusive funktionsfel i spakar eller dörrar som släpper ut maten, matpellets fastnar i butikerna och programvaruavbrott. Dessutom utgör ljudet som kan produceras under öppningen av dörrar eller spakar risken för att konditionera möss för att associera dessa med matleverans, vilket äventyrar tolkningen av effekterna av livsmedelsmanipulation som strikt på grund av tillgång till mat eller på grund av effekter på andra beteenderytmer som sömn / vakna cykel. Det övergripande målet med denna studie var att utveckla ett prisvärt och effektivt system för att manipulera långsiktigt rytmiskt matintag som skulle hjälpa till att lindra många av dessa ovannämnda problem. Först och främst kan matningsapparaten som utvecklats och beskrivs nedan konstrueras till en mycket minimal kostnad jämfört med de automatiserade maskinerna (tabell 2) och kräver inte sofistikerad utbildning för hantering, drift och underhåll. För det andra producerar matningssystemet endast ett vitt bakgrundsbrus och inga höga ljud under matleverans, vilket förhindrar Pavlovian konditionering. Sammantaget är detta utfodringssystem ekonomiskt, mer tillgängligt och pålitligt för forskare samtidigt som det är effektivt vid manipulation av rytmiskt matintag.
Omfattande forskning har genomförts under de senaste decennierna om manipulation av matningsrytmer och deras effekt på fysiologi. Konstruktionen och användningen av matningssystemet som beskrivs här kan användas som en effektiv metod för att manipulera matintaget. Protokollet använder en gemensam 24-timmars timer och en matkopp utformad som en åtta-facks arrangör som nyckelkomponenter i systemet. Burarna kan enkelt konstrueras med hjälp av några få lättillgängliga verktyg, och hanteringen av systemet är användarvänlig. Några av de viktigaste aspekterna av protokollet för att anpassa systemet för att manipulera rytmiskt matintag inkluderar dagligt byte av matkoppar eftersom timern vänder över en 24-timmarsperiod, manuell räkning eller vägning av återstående mat och daglig justering av antalet pellets för AR-utfodring. Vanligtvis ses plastspån när möss är hungriga och inte får tillräckligt med mat. Detta problem kan åtgärdas genom att lägga till några fler matpellets som följer utfodringsregimen tills inga plastspån ses. Vid AR-utfodring, där den dagliga födan behöver justeras, bör man vara försiktig så att man inte inducerar rytmen i födointaget (figur 3B). Därför är det att föredra att antingen lägga till eller subtrahera pellets i motsatta fack hela för att hålla möss arytmiskt matade.
Detta system kan förbättras ytterligare genom att belägga matkopparna med ett lager epoxi för att förhindra att mössen biter på plasten och därmed hjälper till att förlänga matkopparnas livslängd. Timerns yta för placering av matkoppar kan också modifieras för att hjälpa matkoppen att sitta platt och stabil på timern. Detta kan förhindra oavsiktlig stopp av timern orsakad av en ojämnt placerad timer. Några av burkomponenterna, som matkoppar, kan också 3D-skrivas ut för att minska kostnaderna och skräddarsys efter forskarens smak. Detta kan inkludera matkoppar med mer än åtta fack, vilket kan ge en bättre tidsupplösning än det nuvarande 3-timmarsfönstret.
Även om det är mycket effektivt har detta system vissa begränsningar, som att det är arbetsintensivt, där forskaren fortfarande behöver byta matkoppar var 24: e timme och kräver att de manuellt räknar / väger den återstående maten. Dessutom måste timers övervakas då och då för att identifiera potentiella problem och / eller om de slutade fungera. Detta kan uppnås när man räknar de matpellets som återstår efter utfodring (t.ex. genom att bestämma om vissa möss åt mat endast i några få fack och lämnade några fack orörda). En annan begränsning med detta system är att det kanske inte fungerar lika bra med honmöss, eftersom de få experiment som utförts med honor visade att de tenderar att hamstra mat och tugga plasten mer än hanmöss.
Ändå är detta matningssystem mycket effektivt för att manipulera matintaget, är lätt att konstruera, använda, underhålla och är billigt jämfört med de dyra automatiserade matare som finns på marknaden. Den kan enkelt anpassas och modifieras för att passa forskarens krav och behöver ingen särskild utbildning för att driva systemet. Det är viktigt att timers bara producerar en låg mängd konstant vitt brus, vilket förhindrar möss från att associera något ljud med mattillgänglighet.
Sammanfattningsvis beskriver detta dokument ett innovativt utfodringssystem som kan användas för att övervaka daglig matkonsumtion hos möss och kan anpassas för att mata möss på olika paradigmer som tidsbegränsad utfodring, arytmisk utfodring och utfodring på fettrik diet. Detta system lägger till listan över verktyg som kan användas för att ta itu med viktiga frågor inom rytmiskt matintag och dess effekt på fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes ekonomiskt av bidraget R01DK128133 från NIH / NIDDK (till J.S.M) och startfonder från Texas A &M University.
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) | Everbilt | #800172 | |
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) | Everbilt | #801622 | |
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) | USPlastic | #45088 | |
4 inch PVC pipe (10 ft) | Home Depot | #531103 | |
45 mg dustless precision pellets | Bio-Serv | #F0165 | |
6 ft. Extension Cord | HDX | HD#145-017 | |
Food container (eight-compartment jewelry organizer) | JewelrySupply | #PB8301 | |
Indoor Basic Timer | General Electric | #15119 | |
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout | Home Depot | #39103D | |
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) | Research Diets | #D12451 |