Detta protokoll beskriver implantation och utvärdering av melanom i murin choroid med hjälp av optisk koherenstomografi.
Att etablera experimentella koroidala melanommodeller är utmanande när det gäller förmågan att inducera tumörer vid rätt lokalisering. Dessutom begränsar svårigheter att observera bakre koroidalt melanom in vivo tumörplats och tillväxtutvärdering i realtid. Tillvägagångssättet som beskrivs här optimerar tekniker för att etablera koroidalt melanom hos möss via en flerstegs subkoroidal B16LS9-cellinjektionsprocedur. För att möjliggöra precision vid injektion i de små dimensionerna av musuvea, utförs hela proceduren under ett mikroskop. Först bildas en konjunktival peritomi i ögats dorsala temporala område. Därefter skapas ett område i det subkoroidala utrymmet genom att sätta in en nål genom den exponerade sclera. Detta följs av införandet av en trubbig nål i kanalen och injektionen av melanomceller i choroid. Omedelbart efter injektion används icke-invasiv optisk koherenstomografi (OCT) avbildning för att bestämma tumörens plats och framsteg. Retinal frigöring utvärderas som en prediktor för tumörplats och storlek. Den presenterade metoden möjliggör reproducerbar induktion av koroid-lokaliserat melanom hos möss och levande avbildning av tumörtillväxtutvärdering. Som sådan ger det ett värdefullt verktyg för att studera intraokulära tumörer.
Uvealt melanom (UM) är den vanligaste intraokulära primära maligniteten hos vuxna. Cirka 90% av okulära melanom härrör från melanocyter i choroidregionen i uvealkanalen1. UM är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet, eftersom det uppskattas att nära 50% av patienterna utvecklar metastaserad sjukdom, med levern som den viktigaste platsen för metastasering2. Tidig behandling av primära lesioner kan minska risken för metastaser, men ingen effektiv behandling förhindrar bildning av metastaser3.
Standardbehandlingen av uvealt melanom inkluderar bestrålningsbehandling, som är förknippad med synförlust på grund av optisk neuropati, retinopati, torra ögonsyndrom och grå starr. Kirurgisk resektion fördröjs typiskt tills tillväxten av lesionen känns igen och karakteriseras. En sådan fördröjning kan dock möjliggöra metastaserad sjukdomsutveckling4. I vissa fall krävs meningslös enukleation. Naturligtvis äventyrar detta radikala förfarande synen och resulterar i dramatisk estetisk försämring.
Det har gjorts många ansträngningar för att utveckla experimentella modeller för att studera uvealt melanom. Prekliniska djurmodeller som möjliggör noggrann bedömning av denna malignitet är nyckeln till att undersöka nya diagnostiska och terapeutiska strategier för uvealt melanom. Experimentella djurmodeller av okulärt melanom baseras huvudsakligen på inokulering av tumörceller hos möss, råttor och kaniner 5,6. Musmodeller är kostnadseffektiva och används ofta för melanomstudier på grund av deras snabba reproduktionshastighet och höga genomlikhet med människor. Den murina kutana melanomcellinjen B16 används ofta för att inokulera C57BL6-möss och inducera syngena tumörer. När man använder denna modell för att inducera uvealt melanom måste tumörbärande ögon vanligtvis enukleeras 7-14 dagar efter inokulering. Vidare är B16 en mycket invasiv modell. Ögats immunprivilegierade natur stöder metastaser, och metastaser kan vanligtvis detekteras 3-4 veckor efter tumörcellsinokulering. Subkulturer av den ursprungliga B16-linjen visar distinkta metastatiska egenskaper6. Till exempel har Queens melanomlinje en hög metastatisk hastighet 7,8. B16LS9-cellinjen har dendritisk cellmorfologi och härleddes från levermetastaser av C57BL / 6-möss injicerade med föräldrakutan melanomlinje B16F19. När de injicerades i ögats bakre fack visade sig dessa celler bilda intraokulära tumörer, som histologiskt liknar humant uvealt melanom och bildar leverspecifika metastaser i C57BL / 6, men inte Balb / C, möss10,11,12. Genetiskt kännetecknas cellerna av högre uttryck av c-met proto-onkogen, som fungerar som en cellulär receptor för hepatocyttillväxtfaktor13. Däremot metastaserar B16F10, den 10: e passagen av föräldern B16, främst till lungorna när de inokuleras intraokulärt14. Både B16F10 och B16LS9 är pigmenterade12.
Flera viktiga utmaningar begränsar framgången för murina uveala melanommodeller. För det första kan tumörcellreflux leda till extraokulärt eller subkonjunktivalmelanom. För det andra är tumörtillväxt efter intraokulär inokulering av melanomceller ofta mycket varierande, vilket medför svårigheter att utvärdera behandling och framsteg. En annan stor svårighet är den begränsade förmågan att följa tumörtillväxt in vivo. Medan bioluminescerande avbildning, såsom av luciferasuttryckande tumörer, vanligtvis används för att övervaka okulär tumörtillväxt15,16, kan den inte ge information om tumörens intraokulära placering. Därför utförs utvärdering av tumören typiskt efter enukleation av ögat10,17. Detta begränsar kraftigt förmågan att karakterisera tumörprogression och svar på behandlingar i stor utsträckning. Ett annat stort hinder för att studera uvealt melanom är svårigheten att övervaka lesioner hos pigmenterade möss. Nya tillvägagångssätt, som övervinner dessa svårigheter, krävs för att främja forskning av uvealt melanom i djurmodeller.
Optisk koherenstomografi (OCT) ger distinkta möjligheter att avbilda djupt in i de olika delarna av ögat i hög upplösning, vilket är oöverträffat av andra metoder, inklusive ultraljud18,19. OCT-avbildning har använts i djurmodeller för att studera olika ögonsjukdomar20. Nyligen demonstrerades OCT-avbildning som icke-invasivt medel för att utvärdera intraokulär tumörtillväxt21. Protokollet som beskrivs här visar implantation av melanomceller i murin choroid och användningen av OCT för att förutsäga intraokulär tumörlokalisering och storlek vid tidpunkten för cellinokulering.
Uvealt melanom är en förödande sjukdom för vilken nya terapeutiska metoder är mycket nödvändiga. Forskning om uvealt melanom och potentiella behandlingar begränsas dock av de tekniska utmaningarna med uvealt melanom djurmodeller 1,25. Okulära tumörer, som induceras genom intraokulär injektion av cancerceller, är mycket varierande i både lokalisering och storlek, troligen på grund av musögats små dimensioner. Sådan variabilitet är ett hinder för…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes delvis av bidrag 1304/20 från Israel Science Foundation (ISF), Israel, för Arie Marcovich. Vi tackar Shahar Ish-Shalom och Ady Yosipovich, från Institutionen för patologi, Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel, för histologianalys.
10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
C57BL/6 female mice | Envigo | ||
Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
HEPES | satorius | 03-025-1B | |
Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |