تصور Mitophagy مع الأصباغ الفلورية للميتوكوندريا والليزوزوم
Summary
Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن تقييم الميتوفاجي في الجسم الحي يعوقه عدم وجود مقايسات كمية موثوقة. يظهر هنا بروتوكول لمراقبة الميتوفاجي في الخلايا الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري.
Abstract
الميتوكوندريا ، كونها مراكز القوة في الخلية ، تلعب أدوارا مهمة في الطاقة الحيوية ، وتوليد الجذور الحرة ، وتوازن الكالسيوم ، وموت الخلايا المبرمج. Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا ويتم دراستها بشكل عام باستخدام الملاحظة المجهرية ، ولكن من الصعب إجراء فحوصات الميتوفاجي في الجسم الحي . يعد تقييم الميتوفاجي عن طريق تصوير العضيات الحية طريقة بديلة وضرورية لأبحاث الميتوكوندريا. يصف هذا البروتوكول إجراءات استخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية MitoTracker Green وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلورية LysoTracker Red في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ ، وتصور الميتوكوندريا والليزوزوم ، والنتائج المتوقعة. كما يتم توفير خطوات مفصلة لتقييم الميتوفاجي في الخلايا الحية ، بالإضافة إلى ملاحظات فنية حول إعدادات برنامج المجهر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.
Introduction
الميتوكوندريا هي مراكز القوة لجميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا 1,2. بالإضافة إلى إنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية ، تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في عمليات أخرى مثل الطاقة الحيوية ، وتوازن الكالسيوم ، وتوليد الجذور الحرة ، وموت الخلايا المبرمج ، والتوازن الخلوي3،4،5. نظرا لأن الميتوكوندريا تولد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من مجمعات متعددة في سلسلة نقل الإلكترون ، يتم تحفيزها باستمرار عن طريق الإجهاد التأكسدي المحتمل ، والذي يمكن أن يؤدي في النهاية إلى تلف هيكلي واختلال وظيفي عندما ينهار نظام الدفاع المضاد للأكسدة 6,7. تم العثور على خلل الميتوكوندريا للمساهمة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية ، والتنكس العصبي ، وأمراض القلب والأوعية الدموية8. لذلك ، من الأهمية بمكان الحفاظ على صحة سكان الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة. الميتوكوندريا هي عضيات بلاستيكية وديناميكية للغاية. يتم التحكم في مورفولوجيتها ووظيفتها من خلال آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا ، بما في ذلك التعديلات اللاحقة للترجمة (PTM) لبروتينات الميتوكوندريا ، والتولد الحيوي للميتوكوندريا ، والاندماج ، والانشطار ، والميتوفاجي9،10. ينتج عن انشطار الميتوكوندريا بوساطة البروتين 1 المرتبط بالدينامين (DRP1) ، وهو GTPase من عائلة البروتينات الديناميكية الفائقة ، ميتوكوندريا صغيرة ومستديرة ويعزل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا ، والتي يمكن تطهيرها وتحللها بواسطة الميتوفاجي11,12.
Mitophagy هي عملية خلوية تؤدي بشكل انتقائي إلى تحلل الميتوكوندريا عن طريق الالتهام الذاتي ، وعادة ما تحدث في الميتوكوندريا التالفة بعد الإصابة أو الشيخوخة أو الإجهاد. بعد ذلك ، يتم تسليم هذه الميتوكوندريا إلى الليزوزومات للتحلل10. وبالتالي ، فإن الميتوفاجي هي عملية تقويضية تساعد في الحفاظ على كمية ونوعية الميتوكوندريا في حالة صحية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. يلعب دورا حاسما في استعادة التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية والإجهاد الطبيعية13,14. تتميز الخلايا بآلية ميتوفاجي معقدة ، والتي تسببها إشارات مختلفة من الإجهاد الخلوي والتغيرات التنموية. تصنف المسارات التنظيمية Mitophagy على أنها تعتمد على يوبيكويتين أو تعتمد على المستقبلات15,16 ؛ يتم التوسط في الالتهام الذاتي المعتمد على ubiquitin بواسطة كيناز PINK1 وتجنيد يوبيكويتين ligase Parkin E3 إلى الميتوكوندريا 17,18 ، بينما يتضمن الالتهام الذاتي المعتمد على المستقبلات ربط مستقبلات الالتهام الذاتي بسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة LC3 التي تتوسط الميتوفاجي استجابة لتلف الميتوكوندريا19.
المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) هو الطريقة الأكثر استخداما ، ولا يزال أحد أفضل الطرق ، لمراقبة واكتشاف الميتوفاجي20. السمات المورفولوجية للميتوفاجي هي البلعمة الذاتية أو التحلل الذاتي التي تشكلت عن طريق اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، والتي يمكن ملاحظتها من صور المجهر الإلكتروني21. ومع ذلك ، فإن ضعف المجهر الإلكتروني (EM) هو عدم القدرة على مراقبة العمليات الديناميكية للميتوفاجي ، مثل إزالة استقطاب الميتوكوندريا ، وانشطار الميتوكوندريا ، واندماج البلعمة الذاتية والليزوزومات ، في الخلية الحية20. وبالتالي ، فإن تقييم الميتوفاجي من خلال تصوير العضيات الحية هو طريقة بديلة جذابة لأبحاث الميتوكوندريا. تستخدم تقنية التصوير بالخلايا الحية الموصوفة هنا صبغتين فلوريتين لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزومات. عندما يحدث الميتوفاجي ، فإن الميتوكوندريا التالفة أو الزائدة التي تجتاحها البلعمة الذاتية تكون ملطخة باللون الأخضر بواسطة صبغة الميتوكوندريا ، بينما تلطخ الصبغة الحمراء الليزوزومات. يؤدي اندماج هذه البلعمة الذاتية والليزوزومات ، المشار إليها باسم التحلل الذاتي ، إلى تداخل التألق الأخضر والأحمر وظهوره كنقاط صفراء ، مما يشير إلى حدوث الميتوفاجي22. تحتوي صبغة الميتوكوندريا الخلوية (MitoTracker Green) على مجموعة كلوروميثيل كلوروميثيل معتدلة التفاعل مع الثيول لتسمية الميتوكوندريا23. لتسمية الميتوكوندريا ، يتم تحضين الخلايا ببساطة بالصبغة ، التي تنتشر بشكل سلبي عبر غشاء البلازما وتتراكم في الميتوكوندريا النشطة. يمكن لصبغة الميتوكوندريا هذه تلطيخ الخلايا الحية بسهولة ، وهي أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد. صبغة الليزوزوم (LysoTracker Red) هي مسبار حمضي فلوري يستخدم لوضع العلامات على العضيات الحمضية وتتبعها في الخلايا الحية. تظهر هذه الصبغة انتقائية عالية للعضيات الحمضية ويمكنها تسمية الخلايا الحية بشكل فعال بتركيزات نانومولية24.
يتم هنا عرض إجراءات استخدام هذه الأصباغ الفلورية في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ وتصور الميتوكوندريا والليزوزومات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. يمكن استخدامه أيضا لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات ، وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة لتقييم ومراقبة العملية الديناميكية للميتوفاجي في الخلايا الحية ، بما في ذلك البلعمة الذاتية ، والليزوزومات ، والانشطار الميتوكوندريا ، من خلال التلوين المشترك مع الميتوكوندريا الخلوية والأصباغ الليزوزومية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد الميتو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105601 ، 2018YFA0107102) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970333،31901044،) ، وبرنامج أستاذ التعيين الخاص في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
