Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas
Summary
La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.
Abstract
Las mitocondrias, al ser las centrales eléctricas de la célula, juegan un papel importante en la bioenergética, la generación de radicales libres, la homeostasis del calcio y la apoptosis. La mitofagia es el mecanismo primario del control de calidad mitocondrial y generalmente se estudia mediante observación microscópica, sin embargo, los ensayos de mitofagia in vivo son difíciles de realizar. La evaluación de la mitofagia mediante imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo y necesario para la investigación mitocondrial. Este protocolo describe los procedimientos para usar el colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular MitoTracker Green y el colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red en células vivas, incluida la carga de los colorantes, la visualización de las mitocondrias y el lisosoma, y los resultados esperados. También se proporcionan pasos detallados para la evaluación de la mitofagia en células vivas, así como notas técnicas sobre la configuración del software del microscopio. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. Además, se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas y evaluar la morfología mitocondrial.
Introduction
Las mitocondrias son las centrales eléctricas de casi todas las células eucariotas 1,2. Además de la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa, las mitocondrias juegan un papel vital en otros procesos como la bioenergética, la homeostasis del calcio, la generación de radicales libres, la apoptosis y la homeostasis celular 3,4,5. A medida que las mitocondrias generan especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de múltiples complejos en la cadena de transporte de electrones, son estimuladas constantemente por el estrés oxidativo potencial, que eventualmente puede conducir a daños estructurales y disfunción cuando el sistema de defensa antioxidante colapsa 6,7. Se ha encontrado que la disfunción mitocondrial contribuye a muchas enfermedades, incluidos los trastornos metabólicos, la neurodegeneración y las enfermedades cardiovasculares8. Por lo tanto, es crucial mantener poblaciones mitocondriales sanas y su función adecuada. Las mitocondrias son orgánulos altamente plásticos y dinámicos; su morfología y función están controladas por mecanismos de control de calidad mitocondrial, incluyendo modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas mitocondriales, biogénesis mitocondrial, fusión, fisión y mitofagia 9,10. La fisión mitocondrial mediada por la proteína 1 relacionada con la dinamina (DRP1), una GTPasa de la superfamilia de proteínas dinamina, da como resultado mitocondrias pequeñas y redondas y aísla las mitocondrias disfuncionales, que pueden ser eliminadas y degradadas por la mitofagia11,12.
La mitofagia es un proceso celular que degrada selectivamente las mitocondrias por autofagia, que generalmente ocurre en las mitocondrias dañadas después de una lesión, envejecimiento o estrés. Posteriormente, estas mitocondrias son entregadas a los lisosomas para su degradación10. Por lo tanto, la mitofagia es un proceso catabólico que ayuda a mantener la cantidad y calidad de las mitocondrias en un estado saludable en una amplia gama de tipos de células. Desempeña un papel crucial en la restauración de la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y de estrés normales13,14. Las células se caracterizan por un complejo mecanismo de mitofagia, que es inducido por diferentes señales de estrés celular y cambios en el desarrollo. Las vías reguladoras de la mitofagia se clasifican como dependientes de ubiquitina o dependientes de receptores15,16; la autofagia dependiente de ubiquitina está mediada por la quinasa PINK1 y el reclutamiento de ubiquitina ligasa Parkin E3 a las mitocondrias 17,18, mientras que la autofagia dependiente del receptor implica la unión de los receptores de autofagia a la cadena ligera LC3 asociada a microtúbulos que media la mitofagia en respuesta al daño mitocondrial19.
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es el método más utilizado, y sigue siendo uno de los mejores, para observar y detectar la mitofagia20. Las características morfológicas de la mitofagia son autofagosomas o autolisosomas formados por la fusión de autofagosomas con lisosomas, que pueden ser observados a partir de imágenes de microscopía electrónica21. La debilidad de la microscopía electrónica (EM), sin embargo, es la incapacidad de monitorear los procesos dinámicos de la mitofagia, como la despolarización mitocondrial, la fisión mitocondrial y la fusión de autofagosomas y lisosomas, en la célula viva20. Por lo tanto, la evaluación de la mitofagia a través de imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo atractivo para la investigación mitocondrial. La técnica de imagen de células vivas descrita aquí utiliza dos tintes fluorescentes para teñir mitocondrias y lisosomas. Cuando ocurre la mitofagia, las mitocondrias dañadas o superfluas engullidas por autofagosomas se tiñen de verde por el tinte mitocondrial, mientras que el tinte rojo tiñe los lisosomas. La fusión de estos autofagosomas y lisosomas, denominados autolisosomas, hace que la fluorescencia verde y roja se superponga y se manifieste como puntos amarillos, indicando así la ocurrencia de mitofagia22. El colorante mitocondrial permean celular (MitoTracker Green) contiene una fracción clorometilo ligeramente reactiva al tiol para etiquetar las mitocondrias23. Para etiquetar las mitocondrias, las células simplemente se incuban con el tinte, que se difunde pasivamente a través de la membrana plasmática y se acumula en las mitocondrias activas. Este colorante mitocondrial puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído. El colorante lisosómico (LysoTracker Red) es una sonda acidotrópica fluorescente utilizada para etiquetar y rastrear orgánulos ácidos en células vivas. Este colorante exhibe una alta selectividad para orgánulos ácidos y puede etiquetar eficazmente las células vivas a concentraciones nanomolares24.
Aquí se presentan los procedimientos para usar estos tintes fluorescentes en células vivas, incluida la carga de los tintes y la visualización de mitocondrias y lisosomas. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. También se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas, y evaluar la morfología mitocondrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona un método para evaluar y monitorear el proceso dinámico de la mitofagia en células vivas, que involucra autofagosomas, lisosomas y fisión mitocondrial, a través de la tinción conjunta con mitocondrias permisas y colorantes lisosómicos permisionales. El método también se puede utilizar para identificar mitocondrias y evaluar la morfología mitocondrial. Ambos colorantes utilizados en este estudio deben protegerse de la luz, deben evitarse los ciclos múltiples de congelaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado parcialmente por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970333,31901044), y el Programa para Profesor de Nombramiento Especial en las Instituciones de Educación Superior de Shanghai (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
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