Aqui, apresentamos um protocolo detalhado delineando o uso de fragmentos microvasculares isolados de tecido adiposo humano ou de roedores como uma abordagem direta para a engenharia de tecido adiposo bege vascularizado funcional.
A engenharia do tecido adiposo termogênico (por exemplo, tecido adiposo bege ou marrom) tem sido investigada como uma terapia potencial para doenças metabólicas ou para o design de microtecidos personalizados para triagem de saúde e testes de drogas. As estratégias atuais são frequentemente bastante complexas e falham em retratar com precisão as propriedades multicelulares e funcionais do tecido adiposo termogênico. Fragmentos microvasculares, pequenos microvasos intactos constituídos por arteríolas, vênulas e capilares isolados do tecido adiposo, servem como uma única fonte autóloga de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo. Este artigo descreve métodos para otimizar as condições de cultura para permitir a geração de tecido adiposo termogênico tridimensional, vascularizado e funcional a partir de fragmentos microvasculares, incluindo protocolos para isolamento de fragmentos microvasculares do tecido adiposo e condições de cultura. Adicionalmente, as melhores práticas são discutidas, assim como as técnicas de caracterização dos tecidos modificados, e resultados de amostras de fragmentos microvasculares de roedores e humanos são fornecidos. Essa abordagem tem potencial para ser utilizada para o entendimento e desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas.
O objetivo deste protocolo é descrever uma abordagem para o desenvolvimento de tecido adiposo bege vascularizado a partir de uma única fonte potencialmente autóloga, o fragmento microvascular (MVF). Demonstrou-se que os tecidos adiposos marrom e bege exibem propriedades benéficas relacionadas à regulação metabólica; entretanto, o pequeno volume desses depósitos de tecido adiposo em adultos limita o potencial impacto sobre o metabolismo sistêmico, particularmente em condições de doenças como obesidade ou diabetes tipo 21,2,3,4,5,6,7. Há significativo interesse na gordura marrom/bege como alvo terapêutico para a prevenção dos efeitos metabólicos deletérios associados à obesidade e suas comorbidades 8,9,10,11,12.
As FVM são estruturas vasculares que podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo, cultivadas e mantidas em uma configuração tridimensional por longos períodos de tempo13,14,15. Trabalhos anteriores de nosso grupo, entre outros, começaram a explorar a capacidade multicelular e multipotente das MVFs, especificamente no que se refere à formação de tecido adiposo16,17,18. Como um acúmulo deste trabalho, demonstramos recentemente que MVFs derivados de modelos de roedores com diabetes tipo 2 esaudáveis19 e de indivíduos humanos (adultos com mais de 50 anos de idade)20 continham células capazes de serem induzidas a formar tecido adiposo termogênico, ou bege.
Trata-se de uma abordagem inovadora a partir da qual se utiliza uma única fonte de FMV, capaz não só de criar tecido adiposo bege, mas também de seu componente vascular associado e crítico21. O uso dessa técnica pode ser de grande valia para estudos que buscam uma abordagem simples de engenharia tecidual para a formação de tecido adiposo termogênico. Ao contrário de outros métodos que aspiram a manipular tecido adiposo bege 22,23,24,25,26,27,28, o processo descrito neste estudo não requer o uso de múltiplos tipos celulares ou regimes complexos de indução. Modelos vascularizados de gordura bege e branca podem ser criados com MVFs provenientes de fontes de roedores e humanos, demonstrando grande potencial de tradução. O produto final deste protocolo é um tecido adiposo termogênico bege projetado com uma estrutura e função metabólica comparáveis ao tecido adiposo marrom. De modo geral, este protocolo apresenta a ideia de que uma FMVM de fonte facilmente acessível e possivelmente autóloga pode ser uma intervenção terapêutica e uma ferramenta valiosa para o estudo de distúrbios metabólicos.
O campo da engenharia do tecido adiposo marrom/bege é em grande parte imaturo 22,23,24,25,26,27,28, com a maior parte dos modelos adiposos sendo desenvolvidos para o tecido adiposo branco 8,22,31. …
The authors have nothing to disclose.
Dr. Acosta é apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health CA148724 e TL1TR002647. O Dr. Gonzalez é apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais dos Institutos Nacionais de Saúde, sob o número de prêmio F32-0DK122754. Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo National Institutes of Health (5SC1DK122578) e pelo Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade do Texas em San Antonio. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.
Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |