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생체공학

Culture tridimensionnelle de tissu adipeux thermogénique vascularisé à partir de fragments microvasculaires

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64650
, , , , ,
1Department of Biochemistry and Structural Biology,University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering,University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine,University of Texas at San Antonio

Summary

Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant l’utilisation de fragments microvasculaires isolés à partir de rongeurs ou de tissus adipeux humains comme une approche simple pour concevoir un tissu adipeux beige vascularisé fonctionnel.

Abstract

L’ingénierie du tissu adipeux thermogénique (p. ex. tissus adipeux beiges ou bruns) a été étudiée comme traitement potentiel pour les maladies métaboliques ou pour la conception de microtissus personnalisés pour le dépistage médical et les tests de drogues. Les stratégies actuelles sont souvent assez complexes et ne parviennent pas à décrire avec précision les propriétés multicellulaires et fonctionnelles du tissu adipeux thermogénique. Les fragments microvasculaires, petits microvaisseaux intacts composés d’artériole, de veinules et de capillaires isolés du tissu adipeux, constituent une source autologue unique de cellules qui permettent la vascularisation et la formation de tissu adipeux. Cet article décrit les méthodes d’optimisation des conditions de culture pour permettre la génération de tissus adipeux thermogéniques tridimensionnels, vascularisés et fonctionnels à partir de fragments microvasculaires, y compris les protocoles d’isolement des fragments microvasculaires du tissu adipeux et des conditions de culture. De plus, les meilleures pratiques sont discutées, de même que les techniques de caractérisation des tissus modifiés, et les résultats d’échantillons provenant de fragments microvasculaires de rongeurs et humains sont fournis. Cette approche a le potentiel d’être utilisée pour la compréhension et le développement de traitements pour l’obésité et les maladies métaboliques.

Introduction

L’objectif de ce protocole est de décrire une approche pour développer du tissu adipeux beige vascularisé à partir d’une source unique, potentiellement autologue, le fragment microvasculaire (MVF). Il a été démontré que les tissus adipeux bruns et beiges présentent des propriétés bénéfiques liées à la régulation métabolique; Cependant, le faible volume de ces dépôts de tissu adipeux chez les adultes limite l’impact potentiel sur le métabolisme systémique, en particulier dans les maladies telles que l’obésité ou le diabète de type 2 1,2,3,4,5,6,7. La graisse brune/beige suscite un intérêt considérable en tant que cible thérapeutique pour prévenir les effets métaboliques nocifs liés à l’obésité et à ses comorbidités 8,9,10,11,12.

Les MVF sont des structures de vaisseaux qui peuvent être directement isolées du tissu adipeux, cultivées et maintenues dans une configuration tridimensionnelle pendant de longues périodesde temps 13,14,15. Des travaux antérieurs de notre groupe, et d’autres, ont commencé à exploiter la capacité multicellulaire et multipotente des MVF, en particulier en ce qui concerne la formation de tissu adipeux16,17,18. Dans le prolongement de ces travaux, nous avons récemment démontré que les MVF dérivés de modèles de rongeurs de diabète sain et de type 219 et de sujets humains (adultes de plus de 50 ans)20 contenaient des cellules capables d’être induites à former du tissu adipeux thermogénique ou beige.

Il s’agit d’une approche innovante à partir de laquelle une source unique de MVF est utilisée, non seulement capable de créer du tissu adipeux beige, mais aussi son composant vasculaire associéet critique 21. L’utilisation de cette technique pourrait être d’une grande valeur pour les études à la recherche d’une approche simple d’ingénierie tissulaire pour la formation de tissu adipeux thermogénique. Contrairement à d’autres méthodes aspirant à concevoir du tissu adipeux beige 22,23,24,25,26,27,28, le processus décrit dans cette étude ne nécessite pas l’utilisation de plusieurs types de cellules ou de régimes d’induction complexes. Des modèles de graisse beige et blanche vascularisés peuvent être créés avec des MVF provenant de rongeurs et de sources humaines, démontrant un grand potentiel de traduction. Le produit final de ce protocole est un tissu adipeux thermogénique beige modifié avec une structure et une fonction métabolique comparables au tissu adipeux brun. Dans l’ensemble, ce protocole présente l’idée qu’une source facilement accessible et éventuellement autologue MVF peut être une intervention thérapeutique utile et un outil pour étudier les troubles métaboliques.

Protocol

Cette étude a été menée conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et au Règlement d’application sur le bien-être des animaux conformément aux principes du Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas à San Antonio. NOTE: Pour les étapes décrites ci-dessous, des rats Lewis mâles sont utili…

Representative Results

Il existe quelques caractéristiques morphologiques phénotypiques clés du tissu adipeux beige / brun: il est multioculaire / contient de petites gouttelettes lipidiques, possède un grand nombre de mitochondries (la raison de son apparence caractéristique « brunâtre » in vivo), a donc un taux élevé de consommation d’oxygène / bioénergétique mitochondriale, est fortement vascularisé, a augmenté l’absorption de glucose stimulée par la lipolyse / l’insuline et, plus notoirement, exprime des n…

Discussion

Le domaine de l’ingénierie du tissu adipeux brun/beige est largement immature 22,23,24,25,26,27,28, la majeure partie des modèles adipeux étant développés pour le tissu adipeux blanc 8,22,31….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le Dr Acosta est soutenu par les subventions CA148724 et TL1TR002647 des National Institutes of Health. Le Dr Gonzalez Porras est soutenu par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales des National Institutes of Health, sous le numéro d’attribution F32-0DK122754. Ce travail a été soutenu, en partie, par les National Institutes of Health (5SC1DK122578) et le département de génie biomédical de l’Université du Texas à San Antonio. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. Les figures ont été partiellement créées avec Biorender.com.

Materials

Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.
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Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).
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