Dreidimensionale Kultivierung von vaskularisiertem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Verwendung von mikrovaskulären Fragmenten, die aus Nagetier- oder menschlichem Fettgewebe isoliert wurden, als einfachen Ansatz zur Herstellung von funktionellem, vaskularisiertem beigefarbenem Fettgewebe beschreibt.
Abstract
Die Entwicklung von thermogenem Fettgewebe (z. B. beigem oder braunem Fettgewebe) wurde als potenzielle Therapie für Stoffwechselerkrankungen oder für das Design von personalisiertem Mikrogewebe für Gesundheitsuntersuchungen und Arzneimitteltests untersucht. Aktuelle Strategien sind oft sehr komplex und können die multizellulären und funktionellen Eigenschaften von thermogenem Fettgewebe nicht vollständig vollständig abbilden. Mikrovaskuläre Fragmente, kleine intakte Mikrogefäße, die aus Arteriolen, Venolen und Kapillaren bestehen, die aus Fettgewebe isoliert sind, dienen als eine einzige autologen Quelle von Zellen, die die Vaskularisierung und die Bildung von Fettgewebe ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Optimierung der Kulturbedingungen, um die Erzeugung von dreidimensionalem, vaskularisiertem und funktionellem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten zu ermöglichen, einschließlich Protokollen zur Isolierung mikrovaskulärer Fragmente aus Fettgewebe und Kulturbedingungen. Darüber hinaus werden Best Practices sowie Techniken zur Charakterisierung der künstlich hergestellten Gewebe diskutiert, und es werden Probenergebnisse sowohl von Nagetieren als auch von menschlichen mikrovaskulären Fragmenten bereitgestellt. Dieser Ansatz hat das Potenzial, für das Verständnis und die Entwicklung von Therapien für Fettleibigkeit und Stoffwechselerkrankungen genutzt zu werden.
Introduction
Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Entwicklung von vaskularisiertem beigem Fettgewebe aus einem einzigen, potenziell autologen Mikrovaskulärfragment (MVF) zu beschreiben. Es wurde gezeigt, dass braunes und beigefarbenes Fettgewebe vorteilhafte Eigenschaften im Zusammenhang mit der Stoffwechselregulierung aufweist. Das geringe Volumen dieser Fettgewebsdepots bei Erwachsenen begrenzt jedoch die potenziellen Auswirkungen auf den systemischen Stoffwechsel, insbesondere bei Erkrankungen wie Adipositas oder Typ-2-Diabetes 1,2,3,4,5,6,7. Es besteht ein erhebliches Interesse an braunem/beigem Fett als therapeutisches Ziel, um die schädlichen metabolischen Auswirkungen von Adipositas und ihren Komorbiditäten zu verhindern 8,9,10,11,12.
MVFs sind Gefäßstrukturen, die direkt aus Fettgewebe isoliert, kultiviert und über längere Zeiträume in einer dreidimensionalen Konfiguration gehalten werden können13,14,15. Frühere Arbeiten unserer Gruppe und anderer haben begonnen, die multizelluläre und multipotente Kapazität von MVFs zu nutzen, insbesondere in Bezug auf die Bildung von Fettgewebe16,17,18. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir kürzlich gezeigt, dass MVFs, die aus Nagetiermodellen für gesunden und Typ-2-Diabetes19 und von menschlichen Probanden (Erwachsene über 50 Jahre)20 stammen, Zellen enthalten, die zur Bildung von thermogenem oder beigefarbenem Fettgewebe induziert werden können.
Hierin liegt ein innovativer Ansatz vor, bei dem ein MVF aus einer einzigen Quelle verwendet wird, das nicht nur in der Lage ist, beiges Fettgewebe zu erzeugen, sondern auch die damit verbundene und kritische vaskuläre Komponente21. Der Einsatz dieser Technik könnte von großem Wert für Studien sein, die nach einem einfachen Tissue-Engineering-Ansatz für die thermogene Bildung von Fettgewebe suchen. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die darauf abzielen, beiges Fettgewebe 22,23,24,25,26,27,28 zu entwickeln, erfordert der in dieser Studie beschriebene Prozess nicht die Verwendung mehrerer Zelltypen oder komplexer Induktionsschemata. Vaskularisierte beige und weiße Fettmodelle können mit MVFs erstellt werden, die aus Nagetieren und menschlichen Quellen stammen, was ein großes Translationspotenzial aufweist. Das Endprodukt dieses Protokolls ist ein künstlich hergestelltes beigefarbenes thermogenes Fettgewebe mit einer Struktur und Stoffwechselfunktion, die mit braunem Fettgewebe vergleichbar ist. Insgesamt stellt dieses Protokoll die Idee dar, dass eine leicht zugängliche und möglicherweise autologe Quelle MVF eine lohnende therapeutische Intervention und ein Werkzeug zur Untersuchung von Stoffwechselstörungen sein könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Gebiet des braun/beigen Fettgewebe-Engineerings ist weitgehend unausgereift 22,23,24,25,26,27,28, wobei der Großteil der Fettmodelle für weißes Fettgewebe entwickelt wird 8,22,31. Künstlich …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Acosta wird durch die Zuschüsse CA148724 und TL1TR002647 der National Institutes of Health unterstützt. Dr. Gonzalez Porras wird vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer F32-0DK122754 unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health (5SC1DK122578) und dem Department of Biomedical Engineering der University of Texas at San Antonio unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wider. Figuren wurden teilweise mit Biorender.com erstellt.
Materials
| Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
| Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
| Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
| Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
| Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
| Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
| Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
| Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
| Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
| Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
| MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
| Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
| Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
| Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
| Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
| Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
| Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
| Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
| Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
| Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
| Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
| Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |
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