כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השימוש בשברים מיקרו-וסקולריים שבודדו מרקמת מכרסם או מרקמת שומן אנושית כגישה פשוטה להנדסת רקמת שומן פונקציונלית בצבע בז’ וסקולרית.
רקמת שומן תרמוגנית הנדסית (למשל, רקמות שומן בצבע בז’ או חום) נחקרה כטיפול פוטנציאלי למחלות מטבוליות או לתכנון מיקרו-רקמות מותאמות אישית לבדיקת בריאות ובדיקות סמים. האסטרטגיות הנוכחיות הן לעתים קרובות מורכבות למדי ואינן מצליחות לתאר במדויק את התכונות הרב-תאיות והתפקודיות של רקמת השומן התרמוגנית. שברים מיקרו-וסקולריים, מיקרו-כלים קטנים ושלמים המורכבים מעורקים, ורידים ונימים שבודדו מרקמת השומן, משמשים כמקור אוטולוגי יחיד של תאים המאפשרים וסקולריזציה ויצירת רקמת שומן. מאמר זה מתאר שיטות לאופטימיזציה של תנאי תרבית כדי לאפשר יצירה של רקמות שומן תרמוגניות תלת-ממדיות, וסקולריות ומתפקדות ממקטעים מיקרו-וסקולריים, כולל פרוטוקולים לבידוד מקטעים מיקרו-וסקולריים מרקמת השומן ומתנאי תרבית. בנוסף, נדונות שיטות עבודה מומלצות, כמו גם טכניקות לאפיון הרקמות המהונדסות, ותוצאות דגימה הן ממכרסמים והן מקטעים מיקרו-וסקולריים אנושיים מסופקות. לגישה זו יש פוטנציאל לשמש להבנה ופיתוח של טיפולים להשמנת יתר ומחלות מטבוליות.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה לפיתוח רקמת שומן בז’ וסקולרית ממקור יחיד, שעשוי להיות אוטולוגי, מקטע מיקרו-וסקולרי (MVF). רקמות שומן חומות ובז’ הוכחו כבעלות תכונות מועילות הקשורות לוויסות מטבולי; עם זאת, הנפח הקטן של מחסני רקמת שומן אלה במבוגרים מגביל את ההשפעה הפוטנציאלית על חילוף החומרים המערכתי, במיוחד במצבים חולים כגון השמנת יתר או סוכרת מסוג 2 1,2,3,4,5,6,7. קיים עניין משמעותי בשומן חום/בז’ כיעד טיפולי למניעת ההשפעות המטבוליות המזיקות הקשורות להשמנת יתר ותחלואה נלווית 8,9,10,11,12.
MVFs הם מבני כלי דם שניתן לבודד ישירות מרקמת השומן, לגדל בתרבית ולתחזק אותם בתצורה תלת ממדית לפרקי זמן ממושכים 13,14,15. עבודות קודמות של הקבוצה שלנו, ואחרות, החלו לנצל את היכולת הרב-תאית והרב-פוטנטית של MVFs, במיוחד בכל הנוגע להיווצרות רקמת שומן16,17,18. כהצטברות של עבודה זו, הדגמנו לאחרונה כי MVFs שמקורם במודלים של מכרסמים של סוכרת בריאה ומסוג 219 ומנבדקים אנושיים (מבוגרים מעל גיל 50)20 הכילו תאים המסוגלים לקבל השראה ליצירת רקמת שומן תרמוגנית, או בז’.
זוהי גישה חדשנית שממנה נעשה שימוש ב-MVF ממקור יחיד, המסוגל לא רק ליצור רקמת שומן בצבע בז’ אלא גם את מרכיב כלי הדם הקשור והקריטי שלה21. השימוש בטכניקה זו יכול להיות בעל ערך רב עבור מחקרים המחפשים גישה פשוטה מהונדסת רקמות להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית. בניגוד לשיטות אחרות השואפות להנדס רקמת שומן בצבע בז’ 22,23,24,25,26,27,28, התהליך המתואר במחקר זה אינו דורש שימוש במספר סוגי תאים או משטרי אינדוקציה מורכבים. ניתן ליצור מודלים של שומן ובז’ ולבן עם MVFs שמקורם במכרסמים ובמקורות אנושיים, מה שמדגים פוטנציאל תרגום גדול. התוצר הסופי של פרוטוקול זה הוא רקמת שומן תרמוגנית בצבע בז’ מהונדס, בעלת מבנה ותפקוד מטבולי הדומים לרקמת שומן חומה. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג את הרעיון כי MVF מקור נגיש ואולי אוטולוגי עשוי להיות התערבות טיפולית ראויה וכלי לחקר הפרעות מטבוליות.
תחום הנדסת רקמת השומן החומה/בז’ אינו בשל ברובו 22,23,24,25,26,27,28, כאשר רוב דגמי השומן מפותחים עבור רקמת שומן לבנה 8,22,31</su…
The authors have nothing to disclose.
ד”ר אקוסטה נתמך על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות CA148724 ו- TL1TR002647. ד”ר גונזלס פוראס נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס מספר F32-0DK122754. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (5SC1DK122578) ואוניברסיטת טקסס במחלקה להנדסה ביו-רפואית בסן אנטוניו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הדמויות נוצרו חלקית עם Biorender.com.
Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |