Tredimensjonal kultur av vaskularisert termogent fettvev fra mikrovaskulære fragmenter

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver bruken av mikrovaskulære fragmenter isolert fra gnagere eller humant fettvev som en enkel tilnærming til å konstruere funksjonelt, vaskularisert beige fettvev.

Abstract

Engineering termogenic fettvev (f.eks beige eller brunt fettvev) har blitt undersøkt som en potensiell terapi for metabolske sykdommer eller for utforming av personlige mikrovev for helse screening og narkotika testing. Nåværende strategier er ofte ganske komplekse og klarer ikke å nøyaktig skildre de multicellulære og funksjonelle egenskapene til termogent fettvev. Mikrovaskulære fragmenter, små intakte mikrofartøyer som består av arteriol, venuler og kapillærer isolert fra fettvev, tjener som en enkelt autolog kilde til celler som muliggjør vaskularisering og fettvevdannelse. Denne artikkelen beskriver metoder for å optimalisere kulturforhold for å muliggjøre generering av tredimensjonale, vaskulariserte og funksjonelle termogene fettvev fra mikrovaskulære fragmenter, inkludert protokoller for isolering av mikrovaskulære fragmenter fra fettvev og kulturforhold. I tillegg diskuteres beste praksis, som er teknikker for å karakterisere de konstruerte vevene, og prøveresultater fra både gnagere og humane mikrovaskulære fragmenter er gitt. Denne tilnærmingen har potensial til å bli utnyttet for forståelse og utvikling av behandlinger for fedme og metabolsk sykdom.

Introduction

Målet med denne protokollen er å beskrive en tilnærming for å utvikle vaskularisert beige fettvev fra en enkelt, potensielt autolog kilde, mikrovaskulært fragment (MVF). Brunt og beige fettvev har vist seg å vise fordelaktige egenskaper knyttet til metabolsk regulering; Det lille volumet av disse fettvevsdepotene hos voksne begrenser imidlertid den potensielle effekten på systemisk metabolisme, spesielt ved syke tilstander som fedme eller type 2 diabetes 1,2,3,4,5,6,7. Det er betydelig interesse for brunt/beige fett som terapeutisk mål for å forebygge skadelige metabolske effekter knyttet til fedme og dets komorbiditeter 8,9,10,11,12.

MVFer er fartøystrukturer som kan isoleres direkte fra fettvev, dyrkes og opprettholdes i en tredimensjonal konfigurasjon i lengre perioder^13,14,15. Tidligere arbeid fra vår gruppe, og andre, har begynt å utnytte den multicellulære og multipotente kapasiteten til MVFer, spesielt når det gjelder fettvevdannelse^16,17,18. Som en oppbygging av dette arbeidet demonstrerte vi nylig at MVFer avledet fra gnagermodeller av sunn og type 2 diabetes¹⁹ og fra mennesker (voksne over 50 år)²⁰ inneholdt celler som kunne induseres til å danne termogent eller beige fettvev.

Her er en innovativ tilnærming hvorfra en enkelt kilde MVF benyttes, ikke bare i stand til å skape beige fettvev, men også den tilhørende og kritiske vaskulære komponenten²¹. Bruken av denne teknikken kan være av stor verdi for studier som leter etter en enkel vevskonstruert tilnærming for termogen fettvevdannelse. I motsetning til andre metoder som aspirerer til å konstruere beige fettvev 22,23,24,25,26,27,28^, krever prosessen beskrevet i denne studien ikke bruk av flere celletyper eller komplekse induksjonsregimer. Vaskulariserte beige og hvite fettmodeller kan opprettes med MVF-er som stammer fra gnagere og menneskelige kilder, noe som viser stort oversettelsespotensial. Sluttproduktet av denne protokollen er et konstruert beige termogent fettvev med en struktur og metabolsk funksjon som kan sammenlignes med brunt fettvev. Samlet sett presenterer denne protokollen ideen om at en lett tilgjengelig og muligens autolog kilde MVF kan være et verdifullt terapeutisk inngrep og verktøy for å studere metabolske forstyrrelser.

Protocol

Denne studien ble gjennomført i henhold til dyrevelferdsloven og gjennomføringsforskriften for dyrevelferd i henhold til prinsippene i veilederen for stell og bruk av forsøksdyr. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas i San Antonio. MERK: For trinnene beskrevet nedenfor brukes mannlige Lewis-rotter. Små protokolljusteringer må gjøres for en kvinnelig, så vel som musens mikrovaskulære fragmentsamling (MVF)<sup class="xref"…

Representative Results

Det er noen viktige fenotypiske morfologiske egenskaper ved beige/brunt fettvev: det er multilokulært / inneholder små lipiddråper, har et stort antall mitokondrier (årsaken til det karakteristiske “brunlige” utseendet in vivo), har tilsvarende høyt oksygenforbruk / mitokondriell bioenergetikk, er sterkt vaskularisert, har økt lipolyse / insulinstimulert glukoseopptak, og mest notorisk, uttrykker høye nivåer av frakoblingsprotein 1 (UCP1), et mitokondrielt protein involvert i termogen respirasjon<sup cl…

Discussion

Feltet brun/beige fettvevsteknikk er stort sett umodent 22,23,24,25,26,27,28, med hovedtyngden av fettmodeller utviklet for hvitt fettvev ^8,22,31. Konstruerte brune / beige mikrovev består vanligvi…

Materials

Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.