Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий использование микрососудистых фрагментов, выделенных из жировой ткани грызунов или человека, в качестве простого подхода к созданию функциональной, васкуляризированной бежевой жировой ткани.
Инженерная термогенная жировая ткань (например, бежевые или коричневые жировые ткани) была исследована в качестве потенциальной терапии метаболических заболеваний или для разработки персонализированных микротканей для скрининга здоровья и тестирования лекарств. Современные стратегии часто довольно сложны и не могут точно полностью отразить многоклеточные и функциональные свойства термогенной жировой ткани. Микрососудистые фрагменты, небольшие интактные микрососуды, состоящие из артериол, венул и капилляров, выделенных из жировой ткани, служат единым аутологичным источником клеток, которые обеспечивают васкуляризацию и образование жировой ткани. В данной статье описываются методы оптимизации условий культивирования для получения трехмерных, васкуляризированных и функциональных термогенных жировых тканей из микрососудистых фрагментов, включая протоколы выделения микрососудистых фрагментов из жировой ткани и условий культивирования. Кроме того, обсуждаются лучшие практики, а также методы характеристики сконструированных тканей, а также приводятся результаты образцов микрососудистых фрагментов как грызунов, так и человека. Этот подход может быть использован для понимания и разработки методов лечения ожирения и метаболических заболеваний.
Целью этого протокола является описание подхода к развитию васкуляризированной бежевой жировой ткани из одного, потенциально аутологичного источника, микрососудистого фрагмента (MVF). Было продемонстрировано, что коричневые и бежевые жировые ткани проявляют полезные свойства, связанные с метаболической регуляцией; Однако небольшой объем этих депо жировой ткани у взрослых ограничивает потенциальное влияние на системный метаболизм, особенно при таких болезненных состояниях, как ожирение или диабет 2 типа 1,2,3,4,5,6,7. Существует значительный интерес к коричнево-бежевому жиру как терапевтической мишени для предотвращения вредных метаболических эффектов, связанных с ожирением и сопутствующими заболеваниями 8,9,10,11,12.
MVF представляют собой сосудистые структуры, которые могут быть непосредственно изолированы от жировой ткани, культивированы и поддерживаться в трехмерной конфигурации в течение длительных периодов времени13,14,15. Предыдущая работа нашей группы и других ученых начала использовать многоклеточную и мультипотентную способность MVF, особенно в том, что касается образования жировой ткани16,17,18. В качестве наращивания этой работы мы недавно продемонстрировали, что MVF, полученные из моделей грызунов здорового диабета и диабета 2 типа19 и от людей (взрослых старше 50 лет)20, содержат клетки, способные индуцироваться для образования термогенной или бежевой жировой ткани.
Здесь представлен инновационный подход, в котором используется MVF из одного источника, способный не только создавать бежевую жировую ткань, но и связанный с ней и критический сосудистый компонент21. Использование этого метода может иметь большое значение для исследований, ищущих простой тканеинженерный подход к образованию термогенной жировой ткани. В отличие от других методов, направленных на создание бежевой жировой ткани 22,23,24,25,26,27,28, процесс, описанный в этом исследовании, не требует использования нескольких типов клеток или сложных схем индукции. Васкуляризированные модели бежевого и белого жира могут быть созданы с помощью MVF, происходящих от грызунов и людей, демонстрируя большой потенциал перевода. Конечным продуктом этого протокола является сконструированная бежевая термогенная жировая ткань со структурой и метаболической функцией, сравнимыми с бурой жировой тканью. В целом, этот протокол представляет идею о том, что легкодоступный и, возможно, аутологичный источник MVF может быть полезным терапевтическим вмешательством и инструментом для изучения метаболических нарушений.
Область коричнево-бежевой жировой тканевой инженерии в значительной степени незрелая 22,23,24,25,26,27,28, при этом основная часть жировых моделей разрабатывается для белой жировой ткани 8,22,31</su…
The authors have nothing to disclose.
Доктор Акоста поддерживается грантами Национального института здравоохранения CA148724 и TL1TR002647. Доктор Гонсалес Поррас поддерживается Национальным институтом диабета, болезней органов пищеварения и почек Национального института здравоохранения под номером F32-0DK122754. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (5SC1DK122578) и Техасским университетом в Сан-Антонио. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Фигуры были частично созданы с помощью Biorender.com.
Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |