Инновационная вставка, напечатанная на 3D-принтере, предназначена для простого 2D- и 3D-культивирования клеток
Summary
В этой статье недавно разработанный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, представлен в качестве модели совместной культуры и подтвержден путем изучения паракринной межклеточной связи между эндотелиальными клетками и кератиноцитами.
Abstract
Классический анализ непрямой коммуникации между различными типами клеток обуславливает необходимость использования кондиционированных сред. Более того, производство кондиционированных сред остается трудоемким и далеким от физиологических и патологических состояний. Несмотря на то, что несколько моделей кокультивирования коммерчески доступны, они по-прежнему ограничены специфическими анализами и в основном предназначены для двух типов клеток.
Здесь используются напечатанные на 3D-принтере вставки, совместимые с многочисленными функциональными анализами. Вкладыш позволяет разделить одну лунку 6-луночной пластины на четыре отсека. Можно установить широкий спектр комбинаций. Кроме того, в каждой стенке компартментов спроектированы окна таким образом, чтобы потенциальная межклеточная коммуникация между каждым компартментом была возможна в питательной среде в зависимости от объема. Например, паракринная межклеточная коммуникация может быть изучена между четырьмя типами клеток в монослое, в 3D (сфероиды) или путем объединения обоих. Кроме того, в один и тот же отсек можно поместить различные типы клеток в формате 2D или 3D (органоиды). Отсутствие дна во вставках, напечатанных на 3D-принтере, позволяет использовать обычные условия культивирования на пластине, возможное нанесение покрытия на пластину, содержащую вкладыш, и прямую визуализацию с помощью оптической микроскопии. Наличие нескольких компартментов дает возможность собирать различные типы клеток независимо друг от друга или использовать в каждом компартменте разные реагенты для экстракции РНК или белка. В данном исследовании представлена подробная методология использования нового вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, в качестве системы совместного культивирования. Чтобы продемонстрировать некоторые возможности этой гибкой и простой модели, ранее опубликованные функциональные тесты клеточной коммуникации были выполнены в новых 3D-печатных вставках и продемонстрировали свою воспроизводимость. Напечатанные на 3D-принтере вставки и традиционная клеточная культура с использованием кондиционированных сред привели к аналогичным результатам. В заключение, напечатанная на 3D-принтере вставка, представляет собой простое устройство, которое может быть адаптировано к многочисленным моделям кокультур с адгезивными типами клеток.
Introduction
In vivo клетки общаются друг с другом либо напрямую (контакт с клетками), либо опосредованно (путем секреции молекул). Для изучения клеточной коммуникации могут быть разработаны различные модели кокультур, такие как прямая кокультура (различные типы клеток находятся в прямом взаимодействии в одном и том же колодце) и компартментализированная кокультура (различные типы клеток находятся в непрямом взаимодействии в разных компартментах культуральной системы)1. Кроме того, кондиционированные среды могут быть использованы для систем совместного культивирования, где непрямое взаимодействие обеспечивается за счет того, что секретируемые молекулы, содержащиеся в кондиционированных средах эффекторного типа клеток, переносятся в клетку-ответчиктипа 1.
В случае исследований паракринной клеточной коммуникации непрямые системы кокультур предоставляют модели, которые в полной мере отражают клеточные взаимодействия in vivo. Были разработаны и коммерциализированы системы косвенного совместного культивирования, позволившие создать модели косвенной кокультуры 2,3. К сожалению, большинство косвенных систем совместного культивирования предусматривают только два отсека. Другие системы косвенного совместного культивирования предусматривают несколько компартментов, но они менее масштабируемы по сравнению с системой, представленной в настоящей рукописи. Некоторые из них не позволяют провести классическую визуализацию под микроскопом, и в них часто представлены специфические методы нанесения. В нескольких исследованиях паракринная связь между различными типами клеток исследуется с помощью моделиусловной среды 4,5,6,7. Это более простой способ исследования по сравнению с системами косвенной совместной культуры, поскольку он не требует установления конкретных методов или материалов1. С другой стороны, приготовление кондиционированных сред занимает много времени и позволяет получить информацию только об односторонней клеточной сигнализации (от эффектора к ответителю)1.
В данной работе предложен новый, простой способ исследования клеточной коммуникации. Позволяя комбинировать несколько типов клеток в прямом или косвенном взаимодействии, а также в 2D или 3D форматах, напечатанные вставки предоставляют множество преимуществ для простой настройки моделей совместного культивирования. Напечатанная на 3D-принтере вставка, адаптированная для установки в лунки 6-луночных планшетов, имеет круглую форму и позволяет разделить лунку на четыре отсека (два больших и два маленьких; Рисунок 1А). Напечатанные на 3D-принтере вставки характеризуются отсутствием дна. Таким образом, ячейки находятся в непосредственном контакте с пластиной, на которую ставится вкладыш. Кроме того, каждый отсек может быть покрыт независимо от других. Кроме того, поведение клеток можно легко проследить под оптическими микроскопами. Наличие коммуникационных окон в каждой стенке вставки позволяет добавлять в оптимальное время общую среду для проведения различных экспериментов по со-культуре. Для изучения прямой и/или косвенной связи между несколькими типами клеток могут быть выполнены многочисленные комбинации кокультивирования. Например, может быть спроектирована модель непрямой кокультуры между четырьмя различными типами клеток в монослое и/или в 3D (сфероиды). Комбинация моделей прямой и непрямой совместной культуры также может быть выполнена путем смешивания различных типов клеток в одном и том же компартменте. Влияние сложных структур (органоидов, тканевых эксплантов и т.д.) на различные типы клеток может быть еще одним примером моделей, которые могут быть созданы. Кроме того, напечатанные на 3D-принтере вкладыши совместимы с функциональными анализами клеточной биологии (пролиферация, миграция, образование псевдотрубок, дифференцировка и т. д.) и биохимическими тестами (выделение ДНК, РНК, белка, липидов и т. д.). Наконец, напечатанные на 3D-принтере вкладыши обеспечивают широкий спектр экспериментальных схем моделей кокультур с возможностью одновременного комбинирования различных анализов в одном эксперименте в разных отсеках.
Представлены некоторые возможности напечатанных на 3D-принтере вставок, чтобы проверить их в качестве быстрой и простой в использовании модели совместной культуры. По сравнению с ранее опубликованным исследованием, проведенным по коммуникации паракринных клеток, продемонстрирована способность напечатанных на 3D-принтере вставок быть ценной моделью кокультуры. Для оценки этого момента было проведено сравнение регуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток кератиноцитами между напечатанной на 3D-принтере системой вкладышей и классической системой с использованием кондиционированных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют быстро получать результаты, аналогичные традиционным системам, использующим кондиционированные носители. Действительно, напечатанные на 3D-принтере вставки обеспечивают надежную модель для изучения клеточных взаимодействий в обоих направлениях без необходимости производства кондиционированных сред и с возможностью параллельного выполнения анализов пролиферации и миграции в одном и том же эксперименте.
В заключение в данной работе предлагается новая и готовая к использованию модель для изучения клеточной коммуникации. Совместимые со всеми типами адгезивных клеток, напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют выполнять многочисленные комбинации кокультур, которые направлены на то, чтобы быть ближе к условиям in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Непрямая клеточная коммуникация обычно исследуется с использованием кондиционированных сред или устройств для совместной культивации. Подготовка условной среды занимает много времени на начальном этапе экспериментов, и этот метод ограничен односторонним анализом эффектов. Предыду…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было проведено в сотрудничестве с BASF Beauty Care Solutions. Г-жа Чарли Колин-Пьер (Charlie Colin-Pierre) является докторантом BASF/CNRS.
Мы хотели бы поблагодарить г-на Мехди Селлами за концепцию вставок, напечатанных на 3D-принтере.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
