Modellering af oral-esophageal pladecellekarcinom i 3D-organoider
Summary
Denne protokol beskriver de vigtigste trin til at generere og karakterisere murin oral-esophageal 3D-organoider, der repræsenterer normale, præneoplastiske og pladecellekarcinomlæsioner induceret via kemisk carcinogenese.
Abstract
Esophageal pladecellekarcinom (ESCC) er udbredt over hele verden og tegner sig for 90% af alle tilfælde af spiserørkræft hvert år og er den dødeligste af alle humane pladecellekarcinomer. På trods af de seneste fremskridt med at definere de molekylære ændringer, der ledsager ESCC-initiering og -udvikling, er patientprognosen fortsat dårlig. Den funktionelle annotering af disse molekylære ændringer er det nødvendige næste skridt og kræver modeller, der både fanger ESCC’s molekylære egenskaber og let og billigt kan manipuleres til funktionel annotation. Mus behandlet med tobaksrøg mimetisk 4-nitroquinolin 1-oxid (4NQO) danner forudsigeligt ESCC og esophageal preneoplasi. Bemærk, at 4NQO læsioner også opstår i mundhulen, oftest i tungen, såvel som formaven, som alle deler det lagdelte pladeepitel. Disse mus kan dog ikke blot manipuleres til funktionel hypotesetest, da generering af isogene musemodeller er tids- og ressourcekrævende. Heri overvinder vi denne begrænsning ved at generere enkeltcelleafledte tredimensionelle (3D) organoider fra mus behandlet med 4NQO for at karakterisere murin ESCC eller præneoplastiske celler ex vivo. Disse organoider fanger de fremtrædende træk ved ESCC og esophageal preneoplasi, kan billigt og hurtigt udnyttes til at danne isogene modeller og kan bruges til syngeneiske transplantationseksperimenter. Vi demonstrerer, hvordan man genererer 3D-organoider fra normalt, præneoplastisk og SCC murin spiserørvæv og vedligeholder og kryobevarer disse organoider. Anvendelserne af disse alsidige organoider er brede og omfatter udnyttelse af genetisk manipulerede mus og yderligere karakterisering ved flowcytometri eller immunhistokemi, generering af isogene organoidlinjer ved hjælp af CRISPR-teknologier og lægemiddelscreening eller syngeneisk transplantation. Vi mener, at en udbredt anvendelse af de teknikker, der er demonstreret i denne protokol, vil fremskynde fremskridtene på dette område for at bekæmpe den alvorlige byrde, der er forbundet med ESCC.
Introduction
Esophageal pladecellekarcinom (ESCC) er den dødeligste af humane pladecellekarcinomer på grund af dens sene diagnose, terapiresistens og metastase 1,2. ESCC stammer fra det lagdelte pladeepitel, som linjer spiserørets luminale overflade. Planoepitelet består af proliferative basalceller og differentierede celler i det suprabasale cellelag. Under fysiologiske forhold udtrykker basalceller markører som p63, Sox2 og cytokeratin K5 og K14, mens differentierede celler udtrykker K4, K13 og IVL. Basalceller selv er heterogene og omfatter formodede stamceller defineret af markører som K153 og CD734. I homeostase gennemgår basalceller postmitotisk terminal differentiering inden for det suprabasale cellelag, mens differentierede celler migrerer og afskaler ind i lumen for at fuldføre epitelfornyelsen. ESCC minder om deres oprindelsesceller og viser pladecelledifferentiering i varierende grad. ESCC ledsages ofte af multifokale histologiske forløberlæsioner, kendt som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, der omfatter atypiske basaloidceller. Ud over epitelændringer viser ESCC vævsmodellering inden for subepitelrummet, hvor aktiveringen af kræftassocierede fibroblaster (CAF’er) og rekruttering af immun- / inflammatoriske celler finder sted for at fremme det tumorfremmende mikromiljø.
Patogenesen af ESCC involverer genetiske ændringer og eksponering for miljømæssige risikofaktorer. Vigtige genetiske læsioner omfatter inaktivering af tumorsuppressorgenerne TP53 og CDKN2A (p16INK4A) og aktivering af CCND1 (cyclin D1) og EGFR onkogener, som kulminerer i nedsat cellecykluskontrolpunktfunktion, afvigende proliferation og overlevelse under genotoksisk stress relateret til eksponering for kræftfremkaldende stoffer i miljøet. Faktisk interagerer genetiske ændringer tæt med adfærdsmæssige og miljømæssige risikofaktorer, oftest tobaks- og alkoholbrug. Tobaksrøg indeholder humane kræftfremkaldende stoffer såsom acetaldehyd, som også er alkoholens vigtigste metabolit. Acetaldehyd inducerer DNA-addukter og interstrand DNA-tværbindinger, hvilket fører til DNA-skader og akkumulering af DNA-mutationer og kromosomal ustabilitet. I betragtning af overdreven mitogen stimuli og afvigende proliferation fra onkogenaktivering lettes den ondartede transformation af esophageal epitelceller af mekanismer til at klare genotoksisk stress, herunder aktivering af antioxidanter, autofagi og epitel-mesenkymal overgang (EMT). Interessant nok aktiveres disse cytoprotektive funktioner ofte i ESCC-kræftstamceller (CSC’er), der er kendetegnet ved høj CD44 (CD44H) ekspression og har evnen til tumorinitiering, invasion, metastase og terapiresistens 5,6,7.
ESCC er modelleret i cellekultur og i gnavermodeller 8,9. I de sidste tre årtier er der udviklet robuste gensplejsede musemodeller af ESCC. Disse omfatter CCND1 og EGFR transgene mus 10,11 og p53 og p120Ctn knockout mus 12,13. Imidlertid resulterer enkelte genetiske ændringer typisk ikke i hurtigt indsættende ESCC. Denne udfordring er blevet overvundet med brugen af esophageal carcinogener, der rekapitulerer godt de humane genetiske læsioner i ESCC14. For eksempel fremskynder 4-nitroquinolin-1-oxid (4NQO) ESCC-udvikling i CCND1 transgene mus15. I de senere år er formodede esophageal epitelstamceller, stamceller og deres respektive skæbner blevet undersøgt i celleafstamningssporbare musemodeller 3,4. Desuden er disse celleafstamningssporbare mus blevet brugt til at udforske ESCC’s oprindelsesceller, og hvordan sådanne celler giver anledning til CD44H CSC’er via konventionel histologi og omics-baseret molekylær karakterisering7.
Et nyt område relateret til disse musemodeller er den nye anvendelse af cellekulturteknikker til at analysere levende ESCC- og forløberceller i et tredimensionelt (3D) organoidsystem, hvor arkitekturen af det originale væv rekapituleres ex vivo 7,8,9. Disse 3D-organoider vokser hurtigt fra en enkeltcellesuspension isoleret fra murinvæv, herunder primære og metastatiske tumorer (f.eks. lymfeknuder, lunge- og leverlæsioner). Cellerne er indlejret i kældermembranekstrakt (BME) og fodres med et veldefineret serumfrit cellekulturmedium. 3D-organoiderne vokser inden for 7-10 dage, og de resulterende sfæriske strukturer er modtagelige for subkultur, kryopræservering og assays til analyse af en række cellulære egenskaber og funktioner, herunder CSC-markører, EMT, autofagi, proliferation, differentiering og apoptotisk celledød.
Disse metoder kan bredt anvendes til 3D-organoidkulturer etableret fra ethvert lagdelt pladeepitelvæv, såsom hoved- og halsslimhinden (mundhule, tunge, svælg og strubehoved) og endda formaven. Hoved- og halsslimhinden er sammenhængende med spiserøret, og de to væv deler lignende vævsorganisation, funktion og modtagelighed for sygdom. Både pladecellekarcinom (HNSCC) og ESCC deler genetiske læsioner og livsstilsrelaterede miljømæssige risikofaktorer såsom tobaks- og alkoholeksponering. For at understrege denne lighed udvikler mus behandlet med tobaksrøgmimetik 4NQO let både HNSCC og ESCC. I betragtning af den lethed, hvormed protokollerne beskrevet nedenfor kan anvendes til modellering af HNSCC, inkluderer vi specifikke instruktioner til etablering af 3D-organoidkulturer fra disse læsioner.
Heri leverer vi detaljerede protokoller til generering af murine esophageal 3D-organoider (MEO’er), der repræsenterer normale, præneoplastiske og ESCC-læsioner, der udvikler sig hos mus behandlet med 4NQO. Forskellige musestammer kan anvendes, herunder almindelige laboratoriestammer såsom C57BL / 6 og celleafstamningssporbare og andre genetisk manipulerede derivater. Vi lægger vægt på de vigtigste trin, herunder isolering af normalt eller sygt murin esophageal epitel, fremstilling af enkeltcellesuspensioner, dyrkning og overvågning af de voksende 3D-organoider, subkultur, kryopræservering og behandling til efterfølgende analyser, herunder morfologi og andre applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske trin og overvejelser i forbindelse med generering og analyse af markedsøkonomiske aktører i de protokoller, der er beskrevet her. For at sikre reproducerbarhed og stringens i MEO-eksperimenter er både biologiske og tekniske replikater vigtige. For biologiske replikater er to til tre uafhængige mus med ESCC generelt tilstrækkelige pr. eksperimentel tilstand. Det passende antal biologiske replikater kan dog variere afhængigt af de parametre, der skal testes i individuelle undersøgelser. For eks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de delte ressourcer (flowcytometri, molekylær patologi og konfokal og specialiseret mikroskopi) på Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University for teknisk support. Vi takker Dr. Alan Diehl, Adam J. Bass og Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mekanismer for esophageal carcinogenese) og medlemmer af Rustgi og Nakagawa laboratorier for nyttige diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af følgende NIH-tilskud: P01CA098101 (H.N. og A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. og H.N.) og P30CA013696 (A.K.R.). H.N. og CL er modtagere af Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. er modtager af Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. er modtager af The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) og en American Association for Cancer Research Award. J.G. er modtager af American Gastroenterological Association (AGA) prisen.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. 암 연구학. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
