Modélisation du carcinome épidermoïde bucco-œsophagien dans les organoïdes 3D
Summary
Ce protocole décrit les étapes clés pour générer et caractériser les organoïdes 3D murins oraux-œsophagiens qui représentent les lésions de carcinome épidermoïde normal, prénéoplasique et épidermoïde induites par cancérogenèse chimique.
Abstract
Le carcinome épidermoïde de l’œsophage (ESCC) est répandu dans le monde entier, représentant 90% de tous les cas de cancer de l’œsophage chaque année, et est le plus mortel de tous les carcinomes épidermoïdes humains. Malgré les progrès récents dans la définition des changements moléculaires accompagnant l’initiation et le développement de l’ESCC, le pronostic du patient reste sombre. L’annotation fonctionnelle de ces changements moléculaires est la prochaine étape nécessaire et nécessite des modèles qui capturent les caractéristiques moléculaires de l’ESCC et peuvent être manipulés facilement et à peu de frais pour l’annotation fonctionnelle. Les souris traitées avec la fumée de tabac mimétique 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4NQO) forment de manière prévisible un ESCC et une prénéoplasie œsophagienne. Il convient de noter que les lésions de 4NQO apparaissent également dans la cavité buccale, le plus souvent dans la langue, ainsi que dans le préestomac, qui partagent tous l’épithélium pavimenteux stratifié. Cependant, ces souris ne peuvent pas être simplement manipulées pour tester des hypothèses fonctionnelles, car la génération de modèles murins isogéniques nécessite beaucoup de temps et de ressources. Ici, nous surmontons cette limitation en générant des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules uniques à partir de souris traitées avec 4NQO pour caractériser les ESCC murins ou les cellules prénéoplasiques ex vivo. Ces organoïdes capturent les caractéristiques saillantes de l’ESCC et de la prénéoplasie œsophagienne, peuvent être exploités rapidement et à peu de frais pour former des modèles isogéniques et peuvent être utilisés pour des expériences de transplantation syngénique. Nous démontrons comment générer des organoïdes 3D à partir de tissu œsophagien murin normal, prénéoplasique et SCC et maintenir et cryopréserver ces organoïdes. Les applications de ces organoïdes polyvalents sont vastes et comprennent l’utilisation de souris génétiquement modifiées et une caractérisation plus poussée par cytométrie de flux ou immunohistochimie, la génération de lignées organoïdes isogéniques à l’aide des technologies CRISPR et le criblage de médicaments ou la transplantation syngénique. Nous pensons que l’adoption généralisée des techniques démontrées dans ce protocole accélérera les progrès dans ce domaine pour lutter contre le lourd fardeau de la CSC.
Introduction
Le carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC) est le plus mortel des carcinomes épidermoïdes humains, en raison de son diagnostic tardif, de sa résistance au traitement et de ses métastases 1,2. L’ESCC provient de l’épithélium pavimenteux stratifié, qui tapisse la surface luminale de l’œsophage. L’épithélium pavimenteux est composé de cellules basales prolifératives et de cellules différenciées dans la couche de cellules suprabasales. Dans des conditions physiologiques, les cellules basales expriment des marqueurs tels que p63, Sox2 et la cytokératine K5 et K14, tandis que les cellules différenciées expriment K4, K13 et IVL. Les cellules basales elles-mêmes sont hétérogènes et comprennent des cellules souches putatives définies par des marqueurs tels que K153 et CD734. En homéostasie, les cellules basales subissent une différenciation terminale post-mitotique au sein de la couche cellulaire suprabasale, tandis que les cellules différenciées migrent et se desquamate dans la lumière pour compléter le renouvellement épithélial. Rappelant leurs cellules d’origine, l’ESCC présente une différenciation des cellules squameuses à des degrés divers. L’ESCC s’accompagne souvent de lésions précurseurs histologiques multifocales, appelées néoplasie intraépithéliale (IEN) ou dysplasie, comprenant des cellules basaloïdes atypiques. En plus des changements épithéliaux, ESCC affiche un remodelage tissulaire dans le compartiment sous-épithélial, où l’activation des fibroblastes associés au cancer (CAF) et le recrutement de cellules immunitaires / inflammatoires ont lieu pour favoriser le microenvironnement favorisant la tumeur.
La pathogenèse de l’ESCC implique des changements génétiques et l’exposition à des facteurs de risque environnementaux. Les lésions génétiques clés comprennent l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs TP53 et CDKN2A (p16INK4A) et l’activation des oncogènes CCND1 (cycline D1) et EGFR, qui aboutissent à une altération de la fonction de point de contrôle du cycle cellulaire, à une prolifération aberrante et à la survie sous un stress génotoxique lié à l’exposition à des carcinogènes environnementaux. En effet, les changements génétiques interagissent étroitement avec les facteurs de risque comportementaux et environnementaux, le plus souvent la consommation de tabac et d’alcool. La fumée de tabac contient des cancérogènes pour l’homme tels que l’acétaldéhyde, qui est également le principal métabolite de l’alcool. L’acétaldéhyde induit des adduits à l’ADN et des liaisons croisées interbrins de l’ADN, entraînant des dommages à l’ADN et l’accumulation de mutations de l’ADN et d’instabilité chromosomique. Compte tenu des stimuli mitogènes excessifs et de la prolifération aberrante due à l’activation oncogène, la transformation maligne des cellules épithéliales œsophagiennes est facilitée par des mécanismes permettant de faire face au stress génotoxique, notamment l’activation des antioxydants, l’autophagie et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT). Fait intéressant, ces fonctions cytoprotectrices sont souvent activées dans les cellules souches cancéreuses ESCC (CSC) qui sont caractérisées par une expression élevée de CD44 (CD44H) et ont les capacités d’initiation tumorale, d’invasion, de métastases et de résistance au traitement 5,6,7.
L’ESCC a été modélisé en culture cellulaire et dans des modèlesde rongeurs 8,9. Au cours des trois dernières décennies, des modèles robustes de souris génétiquement modifiées d’ESCC ont été développés. Il s’agit notamment des souris transgéniques CCND1 et EGFR 10,11 et p53 et p120Ctn knockout 12,13. Cependant, les changements génétiques uniques n’entraînent généralement pas d’apparition rapide de l’ESCC. Ce défi a été surmonté grâce à l’utilisation de cancérogènes œsophagiens qui récapitulent bien les lésions génétiques humaines dans ESCC14. Par exemple, la 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4NQO) accélère le développement de l’ESCC chez les souris transgéniques CCND1 15. Au cours des dernières années, les cellules souches épithéliales œsophagiennes présumées, les cellules progénitrices et leurs destins respectifs ont été étudiés dans des modèles murins traçables par lignée cellulaire 3,4. De plus, ces souris traçables de lignée cellulaire ont été utilisées pour explorer les cellules d’origine de l’ESCC et comment ces cellules donnent naissance à des CSC CD44H via l’histologie conventionnelle et la caractérisation moléculaire basée sur l’omique7.
Un domaine émergent lié à ces modèles murins est la nouvelle application de techniques de culture cellulaire pour analyser les cellules vivantes de l’ESCC et des précurseurs dans un système organoïde tridimensionnel (3D) dans lequel l’architecture des tissus d’origine est récapitulée ex vivo 7,8,9. Ces organoïdes 3D sont rapidement développés à partir d’une suspension unicellulaire isolée à partir de tissus murins, y compris les tumeurs primaires et métastatiques (par exemple, les ganglions lymphatiques, les poumons et les lésions hépatiques). Les cellules sont incorporées dans un extrait de membrane basale (EMB) et alimentées avec un milieu de culture cellulaire sans sérum bien défini. Les organoïdes 3D se développent en 7 à 10 jours, et les structures sphériques résultantes se prêtent à la sous-culture, à la cryoconservation et aux tests pour analyser une variété de propriétés et de fonctions cellulaires, y compris les marqueurs CSC, l’EMT, l’autophagie, la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire apoptotique.
Ces méthodes peuvent être largement appliquées à des cultures organoïdes 3D établies à partir de n’importe quel tissu épithélial pavimenteux stratifié, tel que la muqueuse de la tête et du cou (cavité buccale, langue, pharynx et larynx) et même le préestomac. La muqueuse de la tête et du cou est contiguë à l’œsophage, et les deux tissus partagent une organisation, une fonction et une susceptibilité tissulaires similaires à la maladie. Le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) et l’ESCC partagent des lésions génétiques et des facteurs de risque environnementaux liés au mode de vie, tels que l’exposition au tabac et à l’alcool. Soulignant cette similitude, les souris traitées avec le 4NQO mimétique de la fumée de tabac développent facilement à la fois HNSCC et ESCC. Compte tenu de la facilité avec laquelle les protocoles décrits ci-dessous peuvent être appliqués à la modélisation HNSCC, nous incluons des instructions spécifiques pour établir des cultures organoïdes 3D à partir de ces lésions.
Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer des organoïdes 3D œsophagiens murins (MEO) représentant des lésions normales, prénéoplasiques et ESCC qui se développent chez les souris traitées avec 4NQO. Diverses souches de souris peuvent être utilisées, y compris des souches de laboratoire courantes telles que C57BL / 6 et des dérivés traçables de lignée cellulaire et d’autres dérivés génétiquement modifiés. Nous mettons l’accent sur les étapes clés, y compris l’isolement de l’épithélium œsophagien murin normal ou malade, la préparation de suspensions unicellulaires, la culture et la surveillance des organoïdes 3D en croissance, la sous-culture, la cryoconservation et le traitement pour les analyses ultérieures, y compris la morphologie et d’autres applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs étapes et considérations critiques pour la génération et l’analyse des opérateurs en économie de marché dans les protocoles décrits ici. Pour assurer la reproductibilité et la rigueur des expériences MEO, les réplications biologiques et techniques sont toutes deux importantes. Pour les réplications biologiques, deux à trois souris indépendantes portant de l’ESCC sont généralement suffisantes par condition expérimentale. Cependant, le nombre approprié de répétitions biologiques …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les ressources partagées (cytométrie en flux, pathologie moléculaire et microscopie confocale et spécialisée) du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia pour leur soutien technique. Nous remercions les Drs Alan Diehl, Adam J. Bass et Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) et les membres des laboratoires Rustgi et Nakagawa pour leurs discussions utiles. Cette étude a été soutenue par les subventions NIH suivantes: P01CA098101 (H.N. et A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. et H.N.) et P30CA013696 (A.K.R.). H.N. et C.L. sont récipiendaires du prix pilote multi-IP du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia. H.N. est récipiendaire du prix Fanconi Anemia Research Fund. F.M.H. est récipiendaire du prix de la Fondation Mark pour la recherche sur le cancer (20-60-51-MOME) et d’un prix de l’American Association for Cancer Research. J.G. est le récipiendaire du prix de l’American Gastroenterological Association (AGA).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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