Modelagem do carcinoma epidermóide orco-esofágico em organoides 3D
Summary
Este protocolo descreve os principais passos para gerar e caracterizar organoides 3D oro-esofágicos murinos que representam lesões normais, pré-neoplásicas e de carcinoma espinocelular induzidas por carcinogênese química.
Abstract
O carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) é prevalente em todo o mundo, responsável por 90% de todos os casos de câncer de esôfago a cada ano, e é o mais mortal de todos os carcinomas de células escamosas humanos. Apesar dos recentes progressos na definição das alterações moleculares que acompanham o início e o desenvolvimento do CEC, o prognóstico dos pacientes permanece ruim. A anotação funcional dessas alterações moleculares é o próximo passo necessário e requer modelos que capturam as características moleculares do CEC e podem ser manipulados de forma rápida e barata para anotação funcional. Camundongos tratados com o 4-óxido de nitroquinolina 1-óxido mimético da fumaça do tabaco (4NQO) previsivelmente formam CEC e pré-neoplasia esofágica. Vale ressaltar que as lesões de 4NQO também surgem na cavidade oral, mais comumente na língua, bem como no pré-estômago, que compartilham o epitélio escamoso estratificado. No entanto, esses camundongos não podem ser simplesmente manipulados para testes de hipóteses funcionais, já que a geração de modelos isogênicos em camundongos consome muito tempo e recursos. Neste estudo, superamos essa limitação gerando organoides tridimensionais (3D) derivados de células únicas a partir de camundongos tratados com 4NQO para caracterizar células murinas ESCC ou células pré-neoplásicas ex vivo. Esses organoides capturam as características salientes do CEC e da pré-neoplasia esofágica, podem ser aproveitados de forma barata e rápida para formar modelos isogênicos e podem ser utilizados para experimentos de transplante singênico. Demonstramos como gerar organoides 3D a partir de tecido esofágico murino normal, pré-neoplásico e CEC e manter e criopreservar esses organoides. As aplicações desses organoides versáteis são amplas e incluem o uso de camundongos geneticamente modificados e posterior caracterização por citometria de fluxo ou imunohistoquímica, a geração de linhagens organoides isogênicas usando tecnologias CRISPR e triagem de drogas ou transplante singênico. Acreditamos que a adoção generalizada das técnicas demonstradas neste protocolo acelerará o progresso neste campo para combater a grave carga de CEC.
Introduction
O carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) é o mais letal dos carcinomas epidermóides humanos, devido ao seu diagnóstico tardio, resistência à terapia e metástase1,2. O CEC origina-se do epitélio escamoso estratificado, que reveste a superfície luminal do esôfago. O epitélio escamoso é composto por células basais proliferativas e células diferenciadas dentro da camada celular suprabasal. Em condições fisiológicas, as células basais expressam marcadores como p63, Sox2 e citoqueratinas K5 e K14, enquanto as células diferenciadas expressam K4, K13 e IVL. As próprias células basais são heterogêneas e incluem células-tronco putativas definidas por marcadores como K153 e CD734. Na homeostase, as células basais sofrem diferenciação terminal pós-mitótica dentro da camada celular suprabasal, enquanto as células diferenciadas migram e descamam para o lúmen para completa renovação epitelial. Lembrando suas células de origem, o CEC exibe diferenciação celular escamosa em graus variados. O CEC é frequentemente acompanhado por lesões precursoras histológicas multifocais, conhecidas como neoplasia intraepitelial (IEE) ou displasia, compreendendo células basaloides atípicas. Além das alterações epiteliais, o CEC exibe remodelação tecidual dentro do compartimento subepitelial, onde ocorre a ativação de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) e o recrutamento de células imunes/inflamatórias para promover o microambiente promotor do tumor.
A patogênese do CEC envolve alterações genéticas e exposição a fatores de risco ambientais. As principais lesões genéticas incluem a inativação dos genes supressores tumorais TP53 e CDKN2A (p16INK4A) e a ativação dos oncogenes CCND1 (ciclina D1) e EGFR, que culminam em comprometimento da função do ponto de verificação do ciclo celular, proliferação aberrante e sobrevivência sob estresse genotóxico relacionado à exposição a carcinógenos ambientais. De fato, as alterações genéticas interagem estreitamente com fatores de risco comportamentais e ambientais, mais comumente o uso de tabaco e álcool. A fumaça do tabaco contém carcinógenos humanos, como o acetaldeído, que também é o principal metabólito do álcool. O acetaldeído induz adutos de DNA e ligações cruzadas de DNA interstrand, levando a danos no DNA e ao acúmulo de mutações no DNA e instabilidade cromossômica. Diante do excesso de estímulos mitogênicos e da proliferação aberrante da ativação de oncogenes, a transformação maligna das células epiteliais esofágicas é facilitada por mecanismos de enfrentamento do estresse genotóxico, incluindo a ativação de antioxidantes, autofagia e transição epitélio-mesenquimal (EMT). Curiosamente, essas funções citoprotetoras são frequentemente ativadas em células-tronco de câncer (CSCs) ESCC, que se caracterizam por alta expressão de CD44 (CD44H) e têm a capacidade de iniciar tumores, invasão, metástase e resistência àterapia5,6,7.
O CEC foi modelado em cultura celular e em modelos deroedores8,9. Nas últimas três décadas, modelos robustos de camundongos geneticamente modificados de CEC foram desenvolvidos. Estes incluem camundongos transgênicos CCND1 e EGFR 10,11 e p53 e camundongos knockout p120Ctn 12,13. No entanto, alterações genéticas isoladas normalmente não resultam em CEC de início rápido. Esse desafio tem sido superado com o uso de carcinógenos esofágicos que recapitulam bem as lesões genéticas humanas noCEC14. Por exemplo, o óxido de 4-nitroquinolina-1 (4NQO) acelera o desenvolvimento de CEC em camundongos transgênicos CCND1 15. Nos últimos anos, células-tronco epiteliais esofágicas putativas, células progenitoras e seus respectivos destinos têm sido investigados em modelos de linhagem celular rastreávelem camundongos3,4. Além disso, esses camundongos rastreáveis por linhagem celular têm sido utilizados para explorar as células de origem do CEC e como tais células dão origem às CSCs CD44H via histologia convencional e caracterização molecular baseada em ômica7.
Uma área emergente relacionada a esses modelos murinos é a nova aplicação de técnicas de cultura celular para analisar CEC vivos e células precursoras em um sistema organoide tridimensional (3D) no qual a arquitetura dos tecidos originais é recapitulada exvivo7,8,9. Esses organoides 3D são rapidamente cultivados a partir de uma suspensão unicelular isolada de tecidos murinos, incluindo tumores primários e metastáticos (por exemplo, lesões linfonodais, pulmonares e hepáticas). As células são incluídas em extrato da membrana basal (BME) e alimentadas com um meio de cultura celular livre de soro bem definido. Os organoides 3D crescem dentro de 7-10 dias, e as estruturas esféricas resultantes são passíveis de subcultura, criopreserva e ensaios para analisar uma variedade de propriedades e funções celulares, incluindo marcadores CSC, EMT, autofagia, proliferação, diferenciação e morte celular apoptótica.
Esses métodos podem ser amplamente aplicados a culturas organoides 3D estabelecidas a partir de qualquer tecido epitelial escamoso estratificado, como a mucosa da cabeça e pescoço (cavidade oral, língua, faringe e laringe) e até mesmo o pré-estômago. A mucosa da cabeça e pescoço é contígua ao esôfago, e os dois tecidos compartilham organização, função e suscetibilidade tecidual semelhantes à doença. Tanto o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) quanto o CEC compartilham lesões genéticas e fatores de risco ambientais relacionados ao estilo de vida, como exposição ao tabaco e ao álcool. Ressaltando essa semelhança, camundongos tratados com o mimético de fumaça de tabaco 4NQO prontamente desenvolvem CEC de cabeça e pescoço. Dada a facilidade com que os protocolos descritos a seguir podem ser aplicados na modelagem do CEC de cabeça e pescoço, incluímos instruções específicas para o estabelecimento de culturas organoides 3D a partir dessas lesões.
Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para a geração de organoides 3D esofágicos murinos (MEOs) representando lesões normais, pré-neoplásicas e CEC que se desenvolvem em camundongos tratados com 4NQO. Várias cepas de camundongos podem ser utilizadas, incluindo cepas comuns de laboratório como C57BL/6 e linhagens celulares rastreáveis e outros derivados geneticamente modificados. Enfatizamos as principais etapas, incluindo o isolamento do epitélio esofágico murino normal ou doente, a preparação de suspensões unicelulares, o cultivo e monitoramento dos organoides 3D em crescimento, a subcultura, a criopreserva e o processamento para análises subsequentes, incluindo morfologia e outras aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas e considerações críticas para a geração e análise de MEOs nos protocolos aqui descritos. Para garantir a reprodutibilidade e o rigor nas experiências MEO, as réplicas biológicas e técnicas são importantes. Para réplicas biológicas, dois a três camundongos independentes portadores de CEC são geralmente suficientes por condição experimental. No entanto, o número adequado de réplicas biológicas pode variar dependendo dos parâmetros a serem testados em estudos individuais. Por exem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos Recursos Compartilhados (Citometria de Fluxo, Patologia Molecular e Microscopia Confocal e Especializada) do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center da Columbia University pelo suporte técnico. Agradecemos aos Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass e Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) e aos membros dos laboratórios Rustgi e Nakagawa pelas discussões úteis. Este estudo foi apoiado pelos seguintes NIH Grants: P01CA098101 (H.N. e A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. e H.N.) e P30CA013696 (A.K.R.). H.N. e C.L. receberam o Prêmio Piloto Multi-PI do Centro Abrangente de Câncer Herbert Irving da Universidade de Columbia. H.N. recebeu o Prêmio Fanconi Anemia Research Fund. F.M.H. recebeu o Prêmio da Fundação Mark para Pesquisa do Câncer (20-60-51-MOME) e um Prêmio da Associação Americana para Pesquisa do Câncer. J.G. recebeu o prêmio da American Gastroenterological Association (AGA).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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