Моделирование плоскоклеточного рака полости рта и пищевода в 3D-органоидах
Summary
В этом протоколе описаны ключевые этапы создания и характеристики 3D-органоидов полости рта и пищевода мышей, которые представляют собой нормальные, предопухолевые и плоскоклеточные поражения карциномы, вызванные химическим канцерогенезом.
Abstract
Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) распространен во всем мире, на его долю приходится 90% всех случаев рака пищевода каждый год, и является самым смертоносным из всех плоскоклеточных карцином человека. Несмотря на недавний прогресс в определении молекулярных изменений, сопровождающих инициацию и развитие ESCC, прогноз пациента остается неблагоприятным. Функциональная аннотация этих молекулярных изменений является необходимым следующим шагом и требует моделей, которые охватывают молекулярные особенности ESCC и могут быть легко и недорого манипулированы для функциональной аннотации. У мышей, получавших миметический 4-нитрохинолиновый 1-оксид табачного дыма (4NQO), предсказуемо образуется ESCC и преднеоплазия пищевода. Следует отметить, что поражения 4NQO также возникают в полости рта, чаще всего на языке, а также в преджелудке, которые имеют многослойный плоский эпителий. Однако этими мышами нельзя просто манипулировать для проверки функциональных гипотез, поскольку создание изогенных моделей мышей требует много времени и ресурсов. Здесь мы преодолеваем это ограничение, генерируя трехмерные (3D) органоиды, полученные из отдельных клеток, у мышей, получавших 4NQO, чтобы охарактеризовать мышиные ESCC или предопухолевые клетки ex vivo. Эти органоиды улавливают характерные черты ESCC и преднеоплазии пищевода, могут быть дешево и быстро использованы для формирования изогенных моделей и могут быть использованы для экспериментов по сингенной трансплантации. Мы демонстрируем, как генерировать 3D-органоиды из нормальной, предопухолевой и SCC мышиной ткани пищевода, а также поддерживать и криоконсервировать эти органоиды. Применение этих универсальных органоидов широко и включает использование генетически модифицированных мышей и дальнейшую характеристику с помощью проточной цитометрии или иммуногистохимии, генерацию изогенных органоидных линий с использованием технологий CRISPR, а также скрининг лекарств или сингенную трансплантацию. Мы считаем, что широкое внедрение методов, продемонстрированных в этом протоколе, ускорит прогресс в этой области в борьбе с тяжелым бременем ESCC.
Introduction
Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) является самым смертоносным из плоскоклеточных карцином человека из-за его поздней диагностики, резистентности к терапии и метастазирования 1,2. ESCC возникает из многослойного плоского эпителия, который выстилает просветную поверхность пищевода. Плоский эпителий состоит из пролиферативных базальных клеток и дифференцированных клеток в супрабазальном клеточном слое. В физиологических условиях базальные клетки экспрессируют такие маркеры, как p63, Sox2 и цитокератин K5 и K14, в то время как дифференцированные клетки экспрессируют K4, K13 и IVL. Базальные клетки сами по себе неоднородны и включают предполагаемые стволовые клетки, определяемые такими маркерами, как K153 и CD734. В гомеостазе базальные клетки подвергаются постмитотической терминальной дифференцировке в супрабазальном клеточном слое, тогда как дифференцированные клетки мигрируют и десквамируются в просвет для полного обновления эпителия. Напоминая о своих клетках происхождения, ESCC в разной степени демонстрирует плоскоклеточную дифференцировку. ESCC часто сопровождается мультифокальными гистологическими поражениями-предшественниками, известными как интраэпителиальная неоплазия (IEN) или дисплазия, включающие атипичные базалоидные клетки. В дополнение к эпителиальным изменениям, ESCC отображает ремоделирование тканей в субэпителиальном компартменте, где происходит активация ассоциированных с раком фибробластов (CAF) и рекрутирование иммунных / воспалительных клеток для содействия микроокружению, способствующему развитию опухоли.
Патогенез ESCC включает генетические изменения и воздействие факторов риска окружающей среды. Ключевые генетические поражения включают инактивацию генов-супрессоров опухолей TP53 и CDKN2A (p16INK4A) и активацию онкогенов CCND1 (циклин D1) и EGFR, которые приводят к нарушению функции контрольных точек клеточного цикла, аберрантной пролиферации и выживаемости в условиях генотоксического стресса, связанного с воздействием канцерогенов окружающей среды. Действительно, генетические изменения тесно взаимодействуют с поведенческими и экологическими факторами риска, чаще всего с употреблением табака и алкоголя. Табачный дым содержит канцерогены для человека, такие как ацетальдегид, который также является основным метаболитом алкоголя. Ацетальдегид индуцирует аддукты ДНК и межцепочечные сшивки ДНК, что приводит к повреждению ДНК и накоплению мутаций ДНК и хромосомной нестабильности. Учитывая чрезмерные митогенные стимулы и аберрантную пролиферацию от активации онкогенов, злокачественной трансформации эпителиальных клеток пищевода способствуют механизмы, позволяющие справляться с генотоксическим стрессом, включая активацию антиоксидантов, аутофагию и эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ). Интересно, что эти цитопротекторные функции часто активируются в раковых стволовых клетках ESCC (CSCs), которые характеризуются высокой экспрессией CD44 (CD44H) и обладают возможностями инициации опухоли, инвазии, метастазирования и резистентности к терапии 5,6,7.
ESCC был смоделирован в клеточной культуре и на моделях грызунов 8,9. За последние три десятилетия были разработаны надежные генно-инженерные мышиные модели ESCC. К ним относятся трансгенные мыши CCND1 и EGFR 10,11 и мыши с нокаутом p53 и p120Ctn 12,13. Тем не менее, единичные генетические изменения обычно не приводят к быстрому началу ESCC. Эта проблема была решена с помощью канцерогенов пищевода, которые хорошо повторяют генетические поражения человека в ESCC14. Например, 4-ниттрохинолин-1-оксид (4NQO) ускоряет развитие ESCC у трансгенных мышей CCND1 15. В последние годы предполагаемые эпителиальные стволовые клетки пищевода, клетки-предшественники и их соответствующие судьбы были исследованы на моделях мышейс прослеживаемой клеточной линией 3,4. Кроме того, эти мыши с прослеживаемой клеточной линией были использованы для изучения клеток происхождения ESCC и того, как такие клетки приводят к образованию CSC CD44H, с помощью обычной гистологии и молекулярной характеристики на основе омиксов7.
Одной из новых областей, связанных с этими моделями мышей, является новое применение методов культивирования клеток для анализа живых ESCC и клеток-предшественников в трехмерной (3D) органоидной системе, в которой архитектура исходных тканей повторяется ex vivo 7,8,9. Эти 3D-органоиды быстро выращиваются из одноклеточной суспензии, выделенной из тканей мышей, включая первичные и метастатические опухоли (например, поражения лимфатических узлов, легких и печени). Клетки встраиваются в экстракт базальной мембраны (BME) и питаются четко определенной средой для культивирования клеток, не содержащей сыворотки. 3D-органоиды растут в течение 7-10 дней, и полученные сферические структуры поддаются субкультуре, криоконсервации и анализам для анализа различных клеточных свойств и функций, включая маркеры CSC, EMT, аутофагию, пролиферацию, дифференцировку и апоптотическую гибель клеток.
Эти методы могут быть широко применены к 3D-органоидным культурам, полученным из любой многослойной плоской эпителиальной ткани, такой как слизистая оболочка головы и шеи (ротовая полость, язык, глотка и гортань) и даже преджелудка. Слизистая оболочка головы и шеи примыкает к пищеводу, и эти две ткани имеют сходную тканевую организацию, функцию и восприимчивость к заболеваниям. Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) и ESCC имеют общие генетические поражения и факторы риска окружающей среды, связанные с образом жизни, такие как воздействие табака и алкоголя. Подчеркивая это сходство, у мышей, получавших миметик табачного дыма 4NQO, легко развиваются как HNSCC, так и ESCC. Учитывая легкость, с которой описанные ниже протоколы могут быть применены к моделированию HNSCC, мы включаем конкретные инструкции по созданию 3D-органоидных культур из этих поражений.
Здесь мы приводим подробные протоколы для создания 3D-органоидов пищевода мышей (MEO), представляющих нормальные, предопухолевые и ESCC-поражения, которые развиваются у мышей, получавших 4NQO. Можно использовать различные штаммы мышей, в том числе распространенные лабораторные штаммы, такие как C57BL / 6, прослеживаемые по клеточному происхождению и другие генетически модифицированные производные. Мы подчеркиваем ключевые этапы, включая выделение нормального или больного эпителия пищевода мыши, приготовление одноклеточных суспензий, культивирование и мониторинг растущих 3D-органоидов, субкультуру, криоконсервацию и обработку для последующего анализа, включая морфологию и другие приложения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько важных шагов и соображений для создания и анализа MEO в описанных здесь протоколах. Для обеспечения воспроизводимости и строгости экспериментов MEO важны как биологические, так и технические реплики. Для биологических реплик обычно достаточно двух-трех независимых …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Общие ресурсы (проточная цитометрия, молекулярная патология, конфокальная и специализированная микроскопия) в Комплексном онкологическом центре им. Герберта Ирвинга при Колумбийском университете за техническую поддержку. Мы благодарим докторов Алана Дила, Адама Басса и Квок-Кин Вонга (NCI P01 «Механизмы канцерогенеза пищевода») и сотрудников лабораторий Рустги и Накагава за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано следующими грантами NIH: P01CA098101 (H.N. и A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(Дж.Г.) R01CA266978 (К.Л.), R01DK132251 (К.Л.), R01DE031873 (К.Л.), P30DK132710 (К.М. и Х.Н.) и P30CA013696 (A.K.R.). Х.Н. и К.Л. являются лауреатами премии Колумбийского университета им. Герберта Ирвинга по комплексному онкологическому центру Multi-PI Pilot Award. Х.Н. является лауреатом премии Фонда исследований анемии Фанкони. F.M.H. является лауреатом премии Фонда Марка за исследования рака (20-60-51-MOME) и премии Американской ассоциации исследований рака. J.G. является лауреатом премии Американской гастроэнтерологической ассоциации (AGA).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. 암 연구학. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
