Modelado del carcinoma de células escamosas oral-esofágico en organoides 3D
Summary
Este protocolo describe los pasos clave para generar y caracterizar organoides 3D oralesesofágicos murinos que representan lesiones de carcinoma de células escamosas normales, preneoplásicas y escamosas inducidas a través de carcinogénesis química.
Abstract
El carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC) es prevalente en todo el mundo, representa el 90% de todos los casos de cáncer de esófago cada año, y es el más mortal de todos los carcinomas de células escamosas humanas. A pesar del progreso reciente en la definición de los cambios moleculares que acompañan al inicio y desarrollo de ESCC, el pronóstico del paciente sigue siendo malo. La anotación funcional de estos cambios moleculares es el siguiente paso necesario y requiere modelos que capturen las características moleculares de ESCC y puedan manipularse de manera fácil y económica para la anotación funcional. Los ratones tratados con el humo de tabaco mimético 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO) forman previsiblemente ESCC y preneoplasia esofágica. Cabe destacar que las lesiones 4NQO también surgen en la cavidad oral, más comúnmente en la lengua, así como en el estómago anterior, que comparten el epitelio escamoso estratificado. Sin embargo, estos ratones no pueden ser simplemente manipulados para pruebas de hipótesis funcionales, ya que la generación de modelos de ratón isogénicos requiere mucho tiempo y recursos. Aquí, superamos esta limitación mediante la generación de organoides tridimensionales (3D) derivados de células individuales de ratones tratados con 4NQO para caracterizar ESCC murino o células preneoplásicas ex vivo. Estos organoides capturan las características sobresalientes de ESCC y preneoplasia esofágica, pueden aprovecharse de manera económica y rápida para formar modelos isogénicos y pueden utilizarse para experimentos de trasplante singénico. Demostramos cómo generar organoides 3D a partir de tejido esofágico murino normal, preneoplásico y SCC y mantener y criopreservar estos organoides. Las aplicaciones de estos organoides versátiles son amplias e incluyen la utilización de ratones genéticamente modificados y una mayor caracterización por citometría de flujo o inmunohistoquímica, la generación de líneas organoides isogénicas utilizando tecnologías CRISPR y la detección de fármacos o el trasplante singénico. Creemos que la adopción generalizada de las técnicas demostradas en este protocolo acelerará el progreso en este campo para combatir la grave carga de ESCC.
Introduction
El carcinoma de células escamosas de esófago (CCE) es el más mortal de los carcinomas de células escamosas humanas, debido a su diagnóstico tardío, resistencia al tratamiento y metástasis 1,2. ESCC surge del epitelio escamoso estratificado, que recubre la superficie luminal del esófago. El epitelio escamoso está compuesto por células basales proliferativas y células diferenciadas dentro de la capa de células suprabasales. En condiciones fisiológicas, las células basales expresan marcadores como p63, Sox2 y citoqueratina K5 y K14, mientras que las células diferenciadas expresan K4, K13 e IVL. Las células basales en sí mismas son heterogéneas e incluyen células madre putativas definidas por marcadores como K153 y CD734. En la homeostasis, las células basales experimentan una diferenciación terminal postmitótica dentro de la capa de células suprabasales, mientras que las células diferenciadas migran y descaman en la luz para completar la renovación epitelial. Con reminiscencias de sus células de origen, ESCC muestra una diferenciación de células escamosas en diversos grados. El ESCC a menudo se acompaña de lesiones precursoras histológicas multifocales, conocidas como neoplasia intraepitelial (IEN) o displasia, que comprenden células basaloides atípicas. Además de los cambios epiteliales, el ESCC muestra la remodelación tisular dentro del compartimiento subepitelial, donde se produce la activación de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y el reclutamiento de células inmunes / inflamatorias para fomentar el microambiente promotor de tumores.
La patogénesis de ESCC implica cambios genéticos y exposición a factores de riesgo ambientales. Las lesiones genéticas clave incluyen la inactivación de los genes supresores de tumores TP53 y CDKN2A (p16INK4A) y la activación de los oncogenes CCND1 (ciclina D1) y EGFR, que culminan en una función deteriorada del punto de control del ciclo celular, proliferación aberrante y supervivencia bajo estrés genotóxico relacionado con la exposición a carcinógenos ambientales. De hecho, los cambios genéticos interactúan estrechamente con los factores de riesgo conductuales y ambientales, más comúnmente el consumo de tabaco y alcohol. El humo del tabaco contiene carcinógenos humanos como el acetaldehído, que también es el principal metabolito del alcohol. El acetaldehído induce aductos de ADN y enlaces cruzados de ADN entre hebras, lo que lleva al daño del ADN y la acumulación de mutaciones en el ADN e inestabilidad cromosómica. Dados los estímulos mitogénicos excesivos y la proliferación aberrante de la activación del oncogén, la transformación maligna de las células epiteliales esofágicas se ve facilitada por mecanismos para hacer frente al estrés genotóxico, incluida la activación de antioxidantes, la autofagia y la transición epitelial-mesenquimal (EMT). Curiosamente, estas funciones citoprotectoras a menudo se activan en las células madre del cáncer ESCC (CSC) que se caracterizan por una alta expresión de CD44 (CD44H) y tienen las capacidades de iniciación tumoral, invasión, metástasis y resistencia a la terapia 5,6,7.
El ESCC ha sido modelado en cultivo celular y en modelos de roedores 8,9. En las últimas tres décadas, se han desarrollado modelos robustos de ratón genéticamente modificados de ESCC. Estos incluyen ratones transgénicos CCND1 y EGFR 10,11 y ratones knockout p53 y p120Ctn 12,13. Sin embargo, los cambios genéticos individuales no suelen dar lugar a ESCC de inicio rápido. Este desafío ha sido superado con el uso de carcinógenos esofágicos que recapitulan bien las lesiones genéticas humanas en ESCC14. Por ejemplo, el óxido de 4-nitroquinolina-1 (4NQO) acelera el desarrollo de ESCC en ratones transgénicos CCND1 15. En los últimos años, las células madre epiteliales esofágicas putativas, las células progenitoras y sus respectivos destinos han sido investigados en modelos de ratón rastreables por linaje celular 3,4. Además, estos ratones rastreables por linaje celular se han utilizado para explorar las células de origen de ESCC y cómo tales células dan lugar a CD44H CSCs a través de histología convencional y caracterización molecular basada en ómicas7.
Un área emergente relacionada con estos modelos de ratón es la aplicación novedosa de técnicas de cultivo celular para analizar células vivas de ESCC y precursoras en un sistema organoide tridimensional (3D) en el que la arquitectura de los tejidos originales se recapitula ex vivo 7,8,9. Estos organoides 3D se cultivan rápidamente a partir de una suspensión unicelular aislada de tejidos murinos, incluidos tumores primarios y metastásicos (por ejemplo, lesiones de ganglios linfáticos, pulmones y hígado). Las células se incrustan en extracto de membrana basal (BME) y se alimentan con un medio de cultivo celular libre de suero bien definido. Los organoides 3D crecen en 7-10 días, y las estructuras esféricas resultantes son susceptibles de subcultivo, criopreservación y ensayos para analizar una variedad de propiedades y funciones celulares, incluidos marcadores CSC, EMT, autofagia, proliferación, diferenciación y muerte celular apoptótica.
Estos métodos se pueden aplicar ampliamente a cultivos de organoides 3D establecidos a partir de cualquier tejido epitelial escamoso estratificado, como la mucosa de la cabeza y el cuello (cavidad oral, lengua, faringe y laringe) e incluso el anteestómago. La mucosa de la cabeza y el cuello son contiguas con el esófago, y los dos tejidos comparten una organización, función y susceptibilidad tisulares similares a la enfermedad. Tanto el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) como el ESCC comparten lesiones genéticas y factores de riesgo ambientales relacionados con el estilo de vida, como la exposición al tabaco y al alcohol. Subrayando esta similitud, los ratones tratados con el mimético del humo del tabaco 4NQO desarrollan fácilmente tanto HNSCC como ESCC. Dada la facilidad con la que los protocolos descritos a continuación se pueden aplicar para modelar HNSCC, incluimos instrucciones específicas para establecer cultivos de organoides 3D a partir de estas lesiones.
En este documento, proporcionamos protocolos detallados para generar organoides 3D esofágicos murinos (MEO) que representan lesiones normales, preneoplásicas y ESCC que se desarrollan en ratones tratados con 4NQO. Se pueden utilizar varias cepas de ratón, incluidas cepas comunes de laboratorio como C57BL / 6 y trazables por linaje celular y otros derivados genéticamente modificados. Enfatizamos los pasos clave, incluido el aislamiento del epitelio esofágico murino normal o enfermo, la preparación de suspensiones unicelulares, el cultivo y monitoreo de los organoides 3D en crecimiento, el subcultivo, la criopreservación y el procesamiento para análisis posteriores, incluida la morfología y otras aplicaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos y consideraciones críticos para la generación y el análisis de MEO en los protocolos descritos aquí. Para garantizar la reproducibilidad y el rigor en los experimentos MEO, las réplicas biológicas y técnicas son importantes. Para las réplicas biológicas, dos o tres ratones independientes que portan ESCC son generalmente suficientes por condición experimental. Sin embargo, el número apropiado de réplicas biológicas puede variar dependiendo de los parámetros que se probarán en estudios indiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Recursos Compartidos (Citometría de Flujo, Patología Molecular y Microscopía Confocal y Especializada) en el Centro Oncológico Integral Herbert Irving de la Universidad de Columbia por su apoyo técnico. Agradecemos a los doctores Alan Diehl, Adam J. Bass y Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) y a los miembros de los laboratorios Rustgi y Nakagawa por sus útiles conversaciones. Este estudio fue apoyado por las siguientes subvenciones de los NIH: P01CA098101 (H.N. y A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. y H.N.) y P30CA013696 (A.K.R.). H.N. y C.L. han recibido el premio Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award de la Universidad de Columbia. H.N. recibió el Premio del Fondo de Investigación de la Anemia de Fanconi. F.M.H. recibió el Premio de la Fundación Mark para la Investigación del Cáncer (20-60-51-MOME) y un Premio de la Asociación Americana para la Investigación del Cáncer. J.G. recibió el premio de la Asociación Americana de Gastroenterología (AGA).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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