Detta protokoll beskriver de viktigaste stegen för att generera och karakterisera murina oral-esofageala 3D-organoider som representerar normala, preneoplastiska och skivepitelcancerskador inducerade via kemisk karcinogenes.
Esofagus skivepitelcancer (ESCC) är utbredd över hela världen och står för 90% av alla fall av matstrupscancer varje år och är den dödligaste av alla mänskliga skivepitelcancer. Trots de senaste framstegen med att definiera de molekylära förändringar som åtföljer ESCC-initiering och utveckling är patientprognosen fortfarande dålig. Den funktionella annoteringen av dessa molekylära förändringar är det nödvändiga nästa steget och kräver modeller som både fångar de molekylära egenskaperna hos ESCC och lätt och billigt kan manipuleras för funktionell annotering. Möss behandlade med tobaksrökmimetisk 4-nitrokinolin 1-oxid (4NQO) bildar förutsägbart ESCC och esofageal preneoplasi. Observera att 4NQO-lesioner också uppstår i munhålan, oftast i tungan, liksom i förmagen, som alla delar det stratifierade skivepitelet. Dessa möss kan dock inte enkelt manipuleras för funktionell hypotestestning, eftersom generering av isogena musmodeller är tids- och resurskrävande. Häri övervinner vi denna begränsning genom att generera encelliga tredimensionella (3D) organoider från möss behandlade med 4NQO för att karakterisera murina ESCC eller preneoplastiska celler ex vivo. Dessa organoider fångar de framträdande egenskaperna hos ESCC och esofageal preneoplasi, kan utnyttjas billigt och snabbt för att bilda isogena modeller och kan användas för syngena transplantationsexperiment. Vi demonstrerar hur man genererar 3D-organoider från normal, preneoplastisk och SCC murin matstrupsvävnad och underhåller och kryokonserverar dessa organoider. Tillämpningarna av dessa mångsidiga organoider är breda och inkluderar användning av genetiskt modifierade möss och ytterligare karakterisering genom flödescytometri eller immunhistokemi, generering av isogena organoidlinjer med CRISPR-teknik och läkemedelsscreening eller syngen transplantation. Vi tror att ett brett antagande av de tekniker som demonstreras i detta protokoll kommer att påskynda framstegen på detta område för att bekämpa den allvarliga bördan av ESCC.
Esofagus skivepitelcancer (ESCC) är den dödligaste av humana skivepitelcancer på grund av dess sena diagnos, terapiresistens och metastaser 1,2. ESCC härrör från det stratifierade skivepitelet, som leder matstrupens luminala yta. Skivepitelet består av proliferativa basalceller och differentierade celler inom det suprabasala cellskiktet. Under fysiologiska förhållanden uttrycker basalceller markörer som p63, Sox2 och cytokeratin K5 och K14, medan differentierade celler uttrycker K4, K13 och IVL. Basalceller själva är heterogena och inkluderar förmodade stamceller definierade av markörer som K153 och CD734. Vid homeostas genomgår basalceller postmitotisk terminal differentiering inom det suprabasala cellskiktet, medan differentierade celler migrerar och desquamate in i lumen för att slutföra epitelförnyelse. ESCC påminner om sina ursprungsceller och visar skivepitelcelldifferentiering i varierande grad. ESCC åtföljs ofta av multifokala histologiska prekursorlesioner, kända som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, bestående av atypiska basaloidceller. Förutom epitelförändringar visar ESCC vävnadsremodellering inom subepitelfacket, där aktivering av cancerassocierade fibroblaster (CAF) och rekrytering av immun / inflammatoriska celler sker för att främja den tumörfrämjande mikromiljön.
Patogenesen av ESCC innebär genetiska förändringar och exponering för miljöriskfaktorer. Viktiga genetiska lesioner inkluderar inaktivering av tumörsuppressorgenerna TP53 och CDKN2A (p16INK4A) och aktivering av CCND1 (cyklin D1) och EGFR-onkogener, som kulminerar i nedsatt cellcykelkontrollpunktsfunktion, avvikande proliferation och överlevnad under genotoxisk stress relaterad till exponering för cancerframkallande ämnen i miljön. Faktum är att genetiska förändringar interagerar nära med beteendemässiga och miljömässiga riskfaktorer, oftast tobaks- och alkoholanvändning. Tobaksrök innehåller cancerframkallande ämnen som acetaldehyd, som också är den viktigaste metaboliten av alkohol. Acetaldehyd inducerar DNA-addukter och interstrand-DNA-tvärbindningar, vilket leder till DNA-skador och ackumulering av DNA-mutationer och kromosomal instabilitet. Med tanke på överdriven mitogen stimuli och avvikande proliferation från onkogenaktivering underlättas den maligna omvandlingen av esofageala epitelceller av mekanismer för att hantera genotoxisk stress, inklusive aktivering av antioxidanter, autofagi och epitelial-mesenkymal övergång (EMT). Intressant nog aktiveras dessa cytoprotektiva funktioner ofta i ESCC-cancerstamceller (CSC) som kännetecknas av högt CD44 (CD44H) uttryck och har förmågan till tumörinitiering, invasion, metastasering och terapiresistens 5,6,7.
ESCC har modellerats i cellodling och i gnagarmodeller 8,9. Under de senaste tre decennierna har robusta genetiskt modifierade musmodeller av ESCC utvecklats. Dessa inkluderar CCND1 och EGFR transgena möss 10,11 och p53 och p120Ctn knockout möss 12,13. Enstaka genetiska förändringar resulterar emellertid vanligtvis inte i snabbt insättande ESCC. Denna utmaning har övervunnits med användning av esofageala cancerframkallande ämnen som rekapitulerar väl de mänskliga genetiska lesionerna i ESCC14. Till exempel påskyndar 4-nitrokinolin-1-oxid (4NQO) ESCC-utvecklingen i CCND1-transgena möss15. Under senare år har förmodade esofageala epiteliala stamceller, stamceller och deras respektive öden undersökts i cellinjespårbara musmodeller 3,4. Vidare har dessa cellinjespårbara möss använts för att utforska ursprungscellerna för ESCC och hur sådana celler ger upphov till CD44H CSC via konventionell histologi och omics-baserad molekylär karakterisering7.
Ett framväxande område relaterat till dessa musmodeller är den nya tillämpningen av cellodlingstekniker för att analysera levande ESCC och prekursorceller i ett tredimensionellt (3D) organoidsystem där arkitekturen hos de ursprungliga vävnaderna rekapituleras ex vivo 7,8,9. Dessa 3D-organoider odlas snabbt från en encellssuspension isolerad från murina vävnader, inklusive primära och metastatiska tumörer (t.ex. lymfkörtel, lung- och leverskador). Cellerna är inbäddade i basalmembranextrakt (BME) och matas med ett väldefinierat serumfritt cellodlingsmedium. 3D-organoiderna växer inom 7-10 dagar, och de resulterande sfäriska strukturerna är mottagliga för subkultur, kryokonservering och analyser för att analysera en mängd olika cellulära egenskaper och funktioner, inklusive CSC-markörer, EMT, autofagi, proliferation, differentiering och apoptotisk celldöd.
Dessa metoder kan i stor utsträckning tillämpas på 3D-organoidkulturer etablerade från någon stratifierad skivepitelvävnad, såsom huvud- och halsslimhinnan (munhålan, tungan, svalget och struphuvudet) och till och med förmagen. Huvud- och halsslemhinnan är angränsande med matstrupen, och de två vävnaderna delar liknande vävnadsorganisation, funktion och mottaglighet för sjukdom. Både skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC) och ESCC delar genetiska skador och livsstilsrelaterade miljöriskfaktorer som tobaks- och alkoholexponering. För att understryka denna likhet utvecklar möss behandlade med tobaksrökmimetisk 4NQO lätt både HNSCC och ESCC. Med tanke på hur lätt protokollen som beskrivs nedan kan tillämpas på modellering av HNSCC, inkluderar vi specifika instruktioner för att upprätta 3D-organoidkulturer från dessa skador.
Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att generera murina esofageala 3D-organoider (MEO) som representerar normala, preneoplastiska och ESCC-lesioner som utvecklas hos möss behandlade med 4NQO. Olika musstammar kan användas, inklusive vanliga laboratoriestammar såsom C57BL / 6 och cellinjespårbara och andra genetiskt modifierade derivat. Vi betonar de viktigaste stegen, inklusive isolering av normalt eller sjukt murint esofagealt epitel, beredning av encellssuspensioner, odling och övervakning av de växande 3D-organoiderna, subkultur, kryokonservering och bearbetning för efterföljande analyser, inklusive morfologi och andra applikationer.
Det finns flera kritiska steg och överväganden för generering och analys av MEO i de protokoll som beskrivs här. För att säkerställa reproducerbarhet och noggrannhet i MEO-experiment är både biologiska och tekniska replikat viktiga. För biologiska replikat är två till tre oberoende möss som bär ESCC i allmänhet tillräckliga per experimentellt tillstånd. Det lämpliga antalet biologiska replikat kan dock variera beroende på vilka parametrar som ska testas i enskilda studier. Till exempel är det för nä…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar de delade resurserna (flödescytometri, molekylär patologi och konfokal och specialiserad mikroskopi) vid Herbert Irving Comprehensive Cancer Center vid Columbia University för teknisk support. Vi tackar Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass och Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) och medlemmar av Rustgi- och Nakakawa-laboratorierna för hjälpsamma diskussioner. Denna studie stöddes av följande NIH-bidrag: P01CA098101 (H.N. och A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. och H.N.) och P30CA013696 (A.K.R.). H.N. och C.L. är mottagare av Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. är mottagare av Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. är mottagare av The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) och en American Association for Cancer Research Award. J.G. är mottagare av American Gastroenterological Association (AGA) utmärkelsen.
0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
21 G needles | BD | 305167 | |
24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
Bacto agar | BD | 214010 | |
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
Forceps | VWR | 82027-386 | |
Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |