이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 태아기 에탄올 노출로 인해 발생하는 매우 다양한 구조적 결함 및 인지 장애가 특징입니다. FASD의 복잡한 병리로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 발달 결함에 대한 현재의 이해에 중요한 것으로 입증되었습니다. Zebrafish는 제브라피쉬와 인간 사이의 유전학 및 발달 모두의 높은 수준의 보존으로 인해 에탄올로 인한 발달 결함을 조사하는 강력한 모델임이 입증되었습니다. 모델 시스템으로서 제브라피쉬는 유전적으로 다루기 쉽고 반투명한 많은 수의 외부 수정 배아를 포함하여 발달 연구에 이상적인 많은 특성을 가지고 있습니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 시기와 투여량을 정확하게 제어할 수 있습니다. 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 중요한 유전 도구 중 하나는 형질전환입니다. 그러나 형질전환 구조체를 생성하고 형질전환 계통을 설정하는 것은 복잡하고 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 제브라피쉬 연구자들은 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템을 구축했습니다. 이 모듈식 시스템은 완전한 Tol2 트랜스포존 기반 형질전환 구조의 빠른 조립을 위해 다중 사이트 게이트웨이 클로닝 접근 방식을 사용합니다. 여기에서는 유연한 Tol2 시스템 도구 상자와 제브라피쉬 형질전환을 위한 준비가 된 형질전환 구조를 생성하고 에탄올 연구에서의 사용을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
서론
태아기 에탄올 노출은 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)라고 하는 구조적 결함 및 인지 장애의 연속체를 유발합니다.1,2,3,4. 여러 요인 간의 복잡한 관계는 인간에서 FASD의 병인을 연구하고 이해하는 것을 어렵게 만듭니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 동물 모델이 사용되었습니다. 이 모델에서 사용할 수 있는 생물학적 및 실험적 도구는 에탄올 기형 유발성의 기계론적 기초에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 것으로 입증되었으며, 이러한 모델 시스템의 결과는 인간 에탄올 연구에서 발견된 것과 현저하게 일치했습니다 5,6. 이 중 제브라피쉬는 에탄올 기형 형성을 연구하는 강력한 모델로 부상했습니다.7,8, 부분적으로는 외부 수정, 높은 번식력, 유전적 다루기 쉬움 및 반투명 배아로 인해 발생합니다. 이러한 강점이 결합되어 제브라피쉬는 형질전환 제브....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 절차에 사용된 모든 제브라피쉬 배아는 확립된 IACUC 프로토콜12에 따라 사육 및 사육되었습니다. 이 프로토콜은 루이빌 대학교의 승인을 받았습니다.
참고: 야생형 제브라피쉬 균주인 AB와 bmp4st72;smad5b1100 이중 돌연변이 계통이 이 연구에 사용되었습니다. 이 과정에서 사용된 모든 물은 멸균 역삼투압수였다. 컨포칼 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 촬영되었습니다. 내배엽 측정은 ImageJ의 측정 도구를 사용하여 이루어졌습니다. 모든 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
1. 솔루션과 미디어 만들기
- 박테리아 배지: 제조업체의 지침에 따라 LB 국물 또는 한천을 녹이고 오토클레이브합니다. 배지를 100mm 페트리 접시에 붓기 전에 암피실린(50μg/mL), 카나마이신(50μg/mL) 또는 암피실린/클로람페니콜 조합(각각 50μg/mL 및 30μg/mL)을 추가합니다.
- 20x 배아 배지 스톡을 만들기 위해, 다음을 1 L의 물에 용해시킨다: 17.5 g의 NaCl, 0.75 g의 KCl, 2....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
형질전환 구축물을 생성하기 위해, 본 발명자들은 Tol2 형질전환 시스템을 사용하였다. 유전자 프로모터/인핸서 요소를 보유하는 p5E, 프로모터/인핸서 요소에 의해 발현되는 유전자를 보유하는 pME 및 최소한 polyA 테일을 보유하는 p3E를 포함한 3개의 진입 벡터를 사용하여 다중 사이트 게이트웨이 LR 클로닝을 통해 형질전환 구축물을 생성했습니다. 대상 벡터인 pDest는 제브라피쉬 배아에서 형질전환 구조체의 게놈 삽입을 위한 Tol2 반복을 제공하며 박테리아 성장에 필요한 모든 필수 유전 정보를 포함합니다(그림 1A). 이 원고의 목적을 위해 우리는 sox17:EGFPCAAX 형질전환 구조체를 만들고 주입했습니다. 내배엽 마커의 프로모터인 sox17은 제브라피쉬의 발달 중인 내배엽에서 막 표지 EGFP를 구동하는 데 사용되었습니다. 비형광단 단백질을 발현하는 형질전환 구조체의 경우, cmlc2:EGFP 와.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
Zebrafish는 에탄올 노출이 발달 및 질병 상태에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다 7,8. 제브라피쉬는 반투명하고, 외부 수정되고, 유전적으로 다루기 쉬운 배아를 대량으로 생산하며, 이를 통해 여러 환경적 맥락에서 여러 이식유전자 표지 조직 및 세포 유형을 동시에 생생하게 이미징할 수 있다19,20. 이러한 강점은 인간과의 강력한 발달 유전 보존과 결합되어 제브라피쉬를 에탄올 7,8의 영향을 이미징하기 위한 강력한 모델 시스템으로 만듭니다. 여기에서 우리는 형질전환 구조물을 생성 및 주입하고 향후 에탄올 연구를 위해 형질전환 제브라피쉬 계통을 설정하기 위한 모듈식 접근 방식에 대한 프로토콜을 설명했습니다........
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 기사에 제시된 연구는 국립 보건원/국립 알코올 남용 연구소(NIH/NIAAA) R00AA023560에서 CBL에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Addgene Tol2 도구 상자 | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| 공기 | 직접 제공 | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| 분석 저울 | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID 모세관 | FHC | 30-30-0 | |
| 염화칼슘 | VWR | 97062-590 | |
| 클로람페니콜 | BioVision | 2486 | |
| EDTA | 피셔 사이언티픽 | BP118-500 | |
| 형광 해부 현미경 | 올림푸스 | SZX16 | |
| 카나마이신 | 피셔 사이언티픽 | BP906 | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | 올림푸스 | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab 기증자 플라스미드 준비 | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB 한천 | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB 육수 | Fisher Scientific | BP1426 | |
| 저EEO/다목적/분자 생물학 등급 Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus | Enzyme Fisher Scientific | 12538200 | |
| 마그네슘 황산염 (헵타하이드레이트) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| 마이크로 피펫 홀더 | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette 팁 10 μ 엘 | Fisher Scientific | 13611106 | |
| 마이크로피펫 팁 1000 μ 엘 | Fisher Scientific | 13611127 | |
| 마이크로피펫 팁 200 μ 엘 | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트 | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 계산 워크시트 | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop 분광 광도계 | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| 페트리 접시 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| 페놀 레드 나트륨 염 | 시그마 Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L 마이크로 피펫 | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L 마이크로 피펫 | Gilson FA10005M | ||
| Pipetman L p2L 마이크로 피펫 | Gilson | FA10001M | |
| 염화칼 | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 인산칼륨(이염기성) | VWR | BDH9266-500G | |
| 압력 인젝터 | 응용 과학 기기 | MPPI-3 | |
| QIAprep 스핀 Miniprep 키트 | Qiagen | 27106 | |
| 중탄산나트륨 | VWR | BDH9280-500G | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | S271-500 | |
| 인산나트륨 (이염기성) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µ M 진공 여과 시스템 | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki 페이지 | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| 수직 피펫터 풀러 | David Kopf Instruments | 720 | |
| 제브라피시 미세 사출 금형 | Adaptive Science Tools | i34 |
참고문헌
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
