Langsigtet dyrkning og overvågning af isolerede Caenorhabditis elegans på faste medier i enheder med flere brønde
Summary
Her præsenteres en optimeret protokol til dyrkning af isolerede individuelle nematoder på faste medier i mikrofabrikerede multibrøndsenheder. Denne tilgang gør det muligt at overvåge individuelle dyr gennem hele deres liv for en række fænotyper relateret til aldring og sundhed, herunder aktivitet, kropsstørrelse og form, bevægelsesgeometri og overlevelse.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans er blandt de mest almindelige modelsystemer, der anvendes i aldringsforskning på grund af dens enkle og billige dyrkningsteknikker, hurtige reproduktionscyklus (~ 3 dage), kort levetid (~ 3 uger) og adskillige tilgængelige værktøjer til genetisk manipulation og molekylær analyse. Den mest almindelige tilgang til gennemførelse af aldringsundersøgelser i C. elegans, herunder overlevelsesanalyse, involverer dyrkning af populationer på titusinder til hundreder af dyr sammen på faste nematodevækstmedier (NGM) i petriplader. Mens denne tilgang indsamler data om en population af dyr, sporer de fleste protokoller ikke individuelle dyr over tid. Præsenteret her er en optimeret protokol til langsigtet dyrkning af individuelle dyr på mikrofabrikerede polydimethylsiloxan (PDMS) enheder kaldet WorMotels. Hver enhed gør det muligt at dyrke op til 240 dyr i små brønde, der indeholder NGM, hvor hver brønd isoleres af en kobbersulfatholdig voldgrav, der forhindrer dyrene i at flygte. Med udgangspunkt i den oprindelige WorMotel-beskrivelse giver dette papir en detaljeret protokol til støbning, forberedelse og udfyldning af hver enhed med beskrivelser af almindelige tekniske komplikationer og råd til fejlfinding. Inden for denne protokol er teknikker til konsekvent indlæsning af NGM i små mængder, konsekvent tørring af både NGM og bakteriel mad, muligheder for levering af farmakologiske indgreb, instruktioner til og praktiske begrænsninger for genbrug af PDMS-enheder og tip til minimering af udtørring, selv i miljøer med lav luftfugtighed. Denne teknik tillader langsgående overvågning af forskellige fysiologiske parametre, herunder stimuleret aktivitet, ustimuleret aktivitet, kropsstørrelse, bevægelsesgeometri, sundhedslængde og overlevelse i et miljø, der ligner standardteknikken til gruppekultur på faste medier i petriplader. Denne metode er kompatibel med dataindsamling med høj kapacitet, når den bruges sammen med automatiseret mikroskopi og analysesoftware. Endelig diskuteres begrænsningerne ved denne teknik samt en sammenligning af denne tilgang til en nyligt udviklet metode, der bruger mikrobakker til dyrkning af isolerede nematoder på faste medier.
Introduction
Caenorhabditis elegans er almindeligt anvendt i aldringsundersøgelser på grund af deres korte generationstid (ca. 3 dage), kort levetid (ca. 3 uger), let dyrkning i laboratoriet, høj grad af evolutionær bevarelse af molekylære processer og veje med pattedyr og bred tilgængelighed af genetiske manipulationsteknikker. I forbindelse med aldringsundersøgelser giver C. elegans mulighed for hurtig generering af levetidsdata og ældre populationer til analyse af fænotyper i det sene liv hos levende dyr. Den typiske fremgangsmåde til gennemførelse af ormeældningsundersøgelser indebærer manuel måling af levetiden for en population af orme, der opretholdes i grupper på 20 til 70 dyr på faste agarnematodevækstmedier (NGM) i 6 cm petriplader1. Brug af alderssynkroniserede populationer muliggør måling af levetid eller tværsnitsfænotyper hos individuelle dyr på tværs af populationen, men denne metode udelukker overvågning af individuelle dyrs egenskaber over tid. Denne tilgang er også arbejdskrævende og begrænser dermed størrelsen af den befolkning, der kan testes.
Der er et begrænset antal dyrkningsmetoder, der giver mulighed for langsgående overvågning af individuelle C. elegans gennem hele deres levetid, og hver har et særskilt sæt fordele og ulemper. Microfluidics-enheder, herunder WormFarm2, NemaLife3 og “adfærdschip”4, blandt andet 5,6,7, tillader overvågning af individuelle dyr over tid. Dyrkning af orme i flydende kultur ved hjælp af plader med flere brønde muliggør ligeledes overvågning af enten individuelle dyr eller små populationer af C. elegans over tid 8,9. Det flydende miljø repræsenterer en særskilt miljøkontekst fra det almindelige kulturmiljø på faste medier i petriplader, som kan ændre aspekter af dyrefysiologi, der er relevante for aldring, herunder fedtindhold og ekspression af stressresponsgener10,11. Evnen til direkte at sammenligne disse undersøgelser med størstedelen af data indsamlet om aldrende C. elegans er begrænset af forskelle i potentielt vigtige miljøvariabler. Worm Corral12 er en tilgang, der er udviklet til at huse individuelle dyr i et miljø, der i højere grad replikerer typisk solid media-kultur. Worm Corral indeholder et forseglet kammer for hvert dyr på et mikroskopglas ved hjælp af hydrogel, hvilket muliggør langsgående overvågning af isolerede dyr. Denne metode bruger standard brightfield-billeddannelse til at registrere morfologiske data, såsom kropsstørrelse og aktivitet. Dyr placeres dog i hydrogelmiljøet som embryoner, hvor de forbliver uforstyrrede i hele deres levetid. Dette kræver anvendelse af betinget sterile mutante eller transgene genetiske baggrunde, hvilket begrænser både kapaciteten til genetisk screening, da hver ny mutation eller transgen skal krydses ind i en baggrund med betinget sterilitet, og kapaciteten til lægemiddelscreening, da behandlinger kun kan anvendes én gang på dyrene som embryoner.
En alternativ metode udviklet af Fang-Yen-laboratoriet tillader dyrkning af orme på faste medier i individuelle brønde af en mikrofabrikeret polydimethylsiloxan (PDMS) enhed kaldet en WorMotel13,14. Hver enhed placeres i en enkeltbrøndsbakke (dvs. med samme dimensioner som en 96-brøndplade) og har 240 brønde adskilt af en voldgrav fyldt med en aversiv opløsning for at forhindre ormene i at rejse mellem brønde. Hver brønd kan huse en enkelt orm i løbet af sin levetid. Enheden er omgivet af vandabsorberende polyacrylamidgelpellets (kaldet “vandkrystaller”), og bakken er forseglet med Parafilm laboratoriefilm for at opretholde fugtigheden og minimere udtørringen af mediet. Dette system gør det muligt at indsamle data om sundhed og levetid for de enkelte dyr, mens brugen af faste medier bedre sammenfatter det miljø, som dyr oplever i langt størstedelen af de offentliggjorte C. elegans-levetidsundersøgelser, hvilket muliggør mere direkte sammenligninger. For nylig er der udviklet en lignende teknik ved hjælp af polystyrenmikrobakker, der oprindeligt blev brugt til mikrocytotoksicitetsassays15 i stedet for PDMS-enheden16. Mikrobakkemetoden giver mulighed for indsamling af individualiserede data for orme dyrket på faste medier og har forbedret kapaciteten til at indeholde orme under forhold, der typisk ville forårsage flugt (f.eks. Stressfaktorer eller kostbegrænsning), idet afvejningen er, at hver mikrobakke kun kan indeholde 96 dyr16, mens multibrøndsenheden, der anvendes her, kan indeholde op til 240 dyr.
Præsenteret her er en detaljeret protokol til forberedelse af multi-well-enheder, der er optimeret til plade-til-plade-konsistens og forberedelse af flere enheder parallelt. Denne protokol blev tilpasset fra den oprindelige protokol fra Fang-Yen-laboratoriet13. Specifikt er der beskrivelser for teknikker til at minimere kontaminering, optimere den konsekvente tørring af både det faste medie og den bakterielle fødekilde og levere RNAi og lægemidler. Dette system kan bruges til at spore individuel sundhed, levetid og andre fænotyper, såsom kropsstørrelse og form. Disse multibrøndsenheder er kompatible med eksisterende systemer med høj kapacitet til måling af levetid, hvilket kan fjerne meget af det manuelle arbejde, der er involveret i traditionelle levetidseksperimenter og give mulighed for automatiseret, direkte levetidsmåling og sundhedssporing i individuelle C. elegans i skala.
Protocol
Representative Results
Discussion
WorMotel-systemet er et kraftfuldt værktøj til indsamling af individualiserede data for hundredvis af isolerede C. elegans over tid. Efter de tidligere undersøgelser ved hjælp af multi-well-enheder til applikationer i udviklingshvile, bevægelsesadfærd og aldring var målet med dette arbejde at optimere forberedelsen af multi-well-enheder til langsigtet overvågning af aktivitet, sundhed og levetid på en højere gennemstrømningsmåde. Dette arbejde giver en detaljeret protokol til forberedelse af enheder …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH R35GM133588 til G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administreret af Arizona Board of Regents og Ellison Medical Foundation.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
