मल्टी-वेल उपकरणों में ठोस मीडिया पर पृथक केनोरहाब्डिस एलिगेंस की दीर्घकालिक संस्कृति और निगरानी
Summary
यहां प्रस्तुत माइक्रोफैब्रिकेटेड मल्टी-वेल उपकरणों में ठोस मीडिया पर पृथक व्यक्तिगत नेमाटोड के संवर्धन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। यह दृष्टिकोण व्यक्तिगत जानवरों को उम्र बढ़ने और स्वास्थ्य से संबंधित विभिन्न प्रकार के फेनोटाइप्स के लिए अपने पूरे जीवन में निगरानी करने की अनुमति देता है, जिसमें गतिविधि, शरीर का आकार और आकार, आंदोलन ज्यामिति और अस्तित्व शामिल हैं।
Abstract
नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस अपनी सरल और सस्ती संस्कृति तकनीकों, तेजी से प्रजनन चक्र (~ 3 दिन), छोटे जीवनकाल (~ 3 सप्ताह), और आनुवंशिक हेरफेर और आणविक विश्लेषण के लिए कई उपलब्ध उपकरणों के कारण उम्र बढ़ने के अनुसंधान में उपयोग की जाने वाली सबसे आम मॉडल प्रणालियों में से एक है। एलिगेंस में उम्र बढ़ने के अध्ययन के संचालन के लिए सबसे आम दृष्टिकोण, जिसमें उत्तरजीविता विश्लेषण शामिल है, में पेट्री प्लेटों में ठोस नेमाटोड विकास मीडिया (एनजीएम) पर एक साथ दसियों से सैकड़ों जानवरों की आबादी का संवर्धन शामिल है। जबकि यह दृष्टिकोण जानवरों की आबादी पर डेटा इकट्ठा करता है, अधिकांश प्रोटोकॉल समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक नहीं करते हैं। यहां प्रस्तुत माइक्रोफैब्रिकेटेड पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) उपकरणों पर व्यक्तिगत जानवरों के दीर्घकालिक संवर्धन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है जिसे वोरमोटल कहा जाता है। प्रत्येक उपकरण एनजीएम युक्त छोटे कुओं में 240 जानवरों को सुसंस्कृत करने की अनुमति देता है, प्रत्येक कुएं को कॉपर सल्फेट युक्त खाई द्वारा अलग किया जाता है जो जानवरों को भागने से रोकता है। मूल वोरमोटल विवरण के आधार पर, यह पेपर सामान्य तकनीकी जटिलताओं के विवरण और समस्या निवारण के लिए सलाह के साथ, प्रत्येक डिवाइस को ढालने, तैयार करने और पॉप्युलेट करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल के भीतर छोटी मात्रा वाले एनजीएम के लगातार लोडिंग के लिए तकनीकें, एनजीएम और बैक्टीरियल भोजन दोनों का लगातार सूखना, औषधीय हस्तक्षेप देने के विकल्प, पीडीएमएस उपकरणों का पुन: उपयोग करने के लिए निर्देश और व्यावहारिक सीमाएं, और कम आर्द्रता वाले वातावरण में भी निर्जलीकरण को कम करने के लिए सुझाव हैं। यह तकनीक पेट्री प्लेटों में ठोस मीडिया पर समूह संस्कृति के लिए मानक तकनीक के समान वातावरण में उत्तेजित गतिविधि, अनियंत्रित गतिविधि, शरीर के आकार, आंदोलन ज्यामिति, स्वास्थ्य और अस्तित्व सहित विभिन्न शारीरिक मापदंडों की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देती है। स्वचालित माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने पर यह विधि उच्च-थ्रूपुट डेटा संग्रह के साथ संगत है। अंत में, इस तकनीक की सीमाओं पर चर्चा की जाती है, साथ ही इस दृष्टिकोण की तुलना हाल ही में विकसित विधि से की जाती है जो ठोस मीडिया पर पृथक नेमाटोड को कल्चर करने के लिए माइक्रोट्रे का उपयोग करती है।
Introduction
केनोरहाब्डिस एलिगेंस का उपयोग आमतौर पर उम्र बढ़ने के अध्ययन में किया जाता है क्योंकि उनकी छोटी पीढ़ी का समय (लगभग 3 दिन), छोटा जीवनकाल (लगभग 3 सप्ताह), प्रयोगशाला में खेती में आसानी, स्तनधारियों के साथ आणविक प्रक्रियाओं और मार्गों के विकासवादी संरक्षण की उच्च डिग्री और आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों की व्यापक उपलब्धता। उम्र बढ़ने के अध्ययन के संदर्भ में, सी एलिगेंस जीवित जानवरों में देर से जीवन फेनोटाइप के विश्लेषण के लिए दीर्घायु डेटा और वृद्ध आबादी की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देते हैं। कृमि उम्र बढ़ने के अध्ययन के संचालन के लिए विशिष्ट दृष्टिकोण में 6 सेमी पेट्रीप्लेटों 1 में ठोस आगर नेमाटोड विकास मीडिया (एनजीएम) पर 20 से 70 जानवरों के समूहों में बनाए गए कीड़े की आबादी के जीवनकाल को मैन्युअल रूप से मापना शामिल है। आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी का उपयोग करने से आबादी भर में अलग-अलग जानवरों में जीवनकाल या पार-अनुभागीय फेनोटाइप ्स के माप की अनुमति मिलती है, लेकिन यह विधि समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की विशेषताओं की निगरानी को रोकती है। यह दृष्टिकोण श्रम-गहन भी है, इस प्रकार परीक्षण की जा सकने वाली आबादी के आकार को सीमित करता है।
सीमित संख्या में संस्कृति विधियां हैं जो अपने पूरे जीवनकाल में व्यक्तिगत सी एलिगेंस की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देती हैं, और प्रत्येक के फायदे और नुकसान का एक अलग सेट है। वर्मफार्म2, नेमालाइफ3, और “व्यवहार” चिप4 सहित माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस, अन्य 5,6,7 के बीच, समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की निगरानी की अनुमति देते हैं। मल्टी-वेल प्लेटों का उपयोग करके तरल संस्कृति में कीड़े का संवर्धन इसी तरह समय 8,9 के साथ व्यक्तिगत जानवरों या सी एलिगेंस की छोटी आबादी की निगरानी की अनुमति देता है। तरल वातावरण पेट्री प्लेटों में ठोस मीडिया पर सामान्य संस्कृति वातावरण से एक अलग पर्यावरणीय संदर्भ का प्रतिनिधित्व करता है, जो पशु शरीर विज्ञान के पहलुओं को बदल सकता है जो उम्र बढ़ने के लिए प्रासंगिक हैं, जिसमें वसा सामग्री और तनाव-प्रतिक्रिया जीन10,11 की अभिव्यक्ति शामिल है। उम्र बढ़ने सी एलिगेंस पर एकत्र किए गए अधिकांश डेटा के लिए इन अध्ययनों की सीधे तुलना करने की क्षमता संभावित महत्वपूर्ण पर्यावरणीय चर में अंतर से सीमित है। वर्म कोरल12 एक ऐसा दृष्टिकोण है जो व्यक्तिगत जानवरों को एक ऐसे वातावरण में रखने के लिए विकसित किया गया है जो विशिष्ट ठोस मीडिया संस्कृति को अधिक बारीकी से दोहराता है। वर्म कोरल में हाइड्रोगेल का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रत्येक जानवर के लिए एक सील कक्ष होता है, जिससे पृथक जानवरों की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति मिलती है। यह विधि शरीर के आकार और गतिविधि जैसे रूपात्मक डेटा रिकॉर्ड करने के लिए मानक ब्राइटफील्ड इमेजिंग का उपयोग करती है। हालांकि, जानवरों को भ्रूण के रूप में हाइड्रोगेल वातावरण में रखा जाता है, जहां वे अपने पूरे जीवनकाल में अबाधित रहते हैं। इसके लिए सशर्त बाँझ उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक आनुवंशिक पृष्ठभूमि के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो आनुवंशिक स्क्रीनिंग की क्षमता दोनों को सीमित करता है, क्योंकि प्रत्येक उपन्यास उत्परिवर्तन या ट्रांसजीन को सशर्त बाँझपन और दवा स्क्रीनिंग की क्षमता के साथ पृष्ठभूमि में पार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि उपचार केवल भ्रूण के रूप में जानवरों पर एक बार लागू किया जा सकता है।
फेंग-येन प्रयोगशाला द्वारा विकसित एक वैकल्पिक विधि एक माइक्रोफैब्रिकेटेड पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) डिवाइस के अलग-अलग कुओं में ठोस मीडिया पर कीड़े की खेती की अनुमति देती है जिसे वोरमोटल13,14 कहा जाता है। प्रत्येक उपकरण को एक एकल-कुएं की ट्रे में रखा जाता है (यानी, 96-वेल प्लेट के समान आयामों के साथ) और इसमें 240 कुएं होते हैं जो कीड़े को कुओं के बीच यात्रा करने से रोकने के लिए एक प्रतिकूल समाधान से भरे खाई से अलग होते हैं। प्रत्येक कुआं अपने जीवनकाल की अवधि के लिए एक एकल कीड़ा रख सकता है। डिवाइस पानी को अवशोषित करने वाले पॉलीक्रिलामाइड जेल छर्रों (“पानी के क्रिस्टल” के रूप में संदर्भित) से घिरा हुआ है, और आर्द्रता को बनाए रखने और मीडिया के निर्जलीकरण को कम करने के लिए ट्रे को पैराफिल्म प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील किया जाता है। यह प्रणाली व्यक्तिगत जानवरों के लिए स्वास्थ्य काल और जीवनकाल डेटा एकत्र करने की अनुमति देती है, जबकि ठोस मीडिया का उपयोग प्रकाशित सी एलिगेंस जीवनकाल अध्ययनों के विशाल बहुमत में जानवरों द्वारा अनुभव किए गए पर्यावरण को बेहतर ढंग से पुन: प्रस्तुत करता है, इस प्रकार अधिक प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है। हाल ही में, पॉलीस्टाइनिन माइक्रोट्रे का उपयोग करके एक समान तकनीक विकसित की गई है जो मूल रूप से पीडीएमएस डिवाइस16 के स्थान पर माइक्रोसाइटोटॉक्सिसिटीपरख 15 के लिए उपयोग की जाती थी। माइक्रोट्रे विधि ठोस मीडिया पर संवर्धित कीड़े के लिए व्यक्तिगत डेटा के संग्रह की अनुमति देती है और इसमें उन स्थितियों के तहत कीड़े रखने की क्षमता में सुधार होता है जो आम तौर पर पलायन (जैसे, तनाव या आहार प्रतिबंध) का कारण बनते हैं, व्यापार-बंद के साथ कि प्रत्येक माइक्रोट्रे में केवल 96 जानवर हो सकते हैं, जबकि यहां उपयोग किए जाने वाले मल्टी-वेल डिवाइस में 240जानवर हो सकते हैं।
यहां प्रस्तुत मल्टी-वेल डिवाइस तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो प्लेट-टू-प्लेट स्थिरता और समानांतर में कई उपकरणों की तैयारी के लिए अनुकूलित है। इस प्रोटोकॉल को फेंग-येन प्रयोगशाला13 से मूल प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था। विशेष रूप से, संदूषण को कम करने, ठोस मीडिया और जीवाणु खाद्य स्रोत दोनों के लगातार सूखने का अनुकूलन करने और आरएनएआई और दवाओं को वितरित करने के लिए तकनीकों के लिए विवरण हैं। इस प्रणाली का उपयोग व्यक्तिगत स्वास्थ्य, जीवनकाल और अन्य फेनोटाइप, जैसे शरीर के आकार और आकार को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। ये मल्टी-वेल डिवाइस जीवनकाल को मापने के लिए मौजूदा उच्च-थ्रूपुट सिस्टम के साथ संगत हैं, जो पारंपरिक जीवनकाल प्रयोगों में शामिल अधिकांश मैनुअल श्रम को हटा सकते हैं और पैमाने पर व्यक्तिगत सी एलिगेंस में स्वचालित, प्रत्यक्ष दीर्घायु माप और स्वास्थ्य ट्रैकिंग का अवसर प्रदान कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
WorMotel प्रणाली समय के साथ सैकड़ों पृथक C. एलिगेंस के लिए व्यक्तिगत डेटा एकत्र करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। विकास ता्मक गतिशीलता, लोकोमोटर व्यवहार और उम्र बढ़ने में अनुप्रयोगों के लिए मल्टी-वेल उप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच आर 35 जीएम 133588 द्वारा जीएलएस को समर्थित किया गया था, जीएलएस को यूनाइटेड स्टेट्स नेशनल एकेडमी ऑफ मेडिसिन कैटेलिस्ट अवार्ड, एरिज़ोना बोर्ड ऑफ रीजेंट्स और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन द्वारा प्रशासित एरिज़ोना टेक्नोलॉजी एंड रिसर्च इनिशिएटिव फंड राज्य द्वारा।
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
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