Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços
Summary
Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo de nematoides individuais isolados em meios sólidos em dispositivos microfabricados de múltiplos poços. Essa abordagem permite que animais individuais sejam monitorados ao longo de suas vidas para uma variedade de fenótipos relacionados ao envelhecimento e à saúde, incluindo atividade, tamanho e forma corporal, geometria do movimento e sobrevivência.
Abstract
O nematoide Caenorhabditis elegans está entre os sistemas modelo mais comuns usados na pesquisa do envelhecimento devido às suas técnicas de cultura simples e baratas, ciclo de reprodução rápido (~3 dias), curta vida útil (~3 semanas) e inúmeras ferramentas disponíveis para manipulação genética e análise molecular. A abordagem mais comum para a realização de estudos de envelhecimento em C. elegans, incluindo análise de sobrevivência, envolve o cultivo de populações de dezenas a centenas de animais em conjunto em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM) em placas de Petri. Embora essa abordagem reúna dados sobre uma população de animais, a maioria dos protocolos não rastreia animais individuais ao longo do tempo. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo a longo prazo de animais individuais em dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) chamados WorMotels. Cada dispositivo permite que até 240 animais sejam cultivados em pequenos poços contendo NGM, com cada poço isolado por um fosso contendo sulfato de cobre que impede a fuga dos animais. Com base na descrição original do WorMotel, este documento fornece um protocolo detalhado para moldar, preparar e preencher cada dispositivo, com descrições de complicações técnicas comuns e conselhos para solução de problemas. Dentro desse protocolo estão técnicas para o carregamento consistente de NGM de pequeno volume, a secagem consistente tanto da NGM quanto do alimento bacteriano, opções para a realização de intervenções farmacológicas, instruções e limitações práticas para a reutilização de dispositivos PDMS e dicas para minimizar a dessecação, mesmo em ambientes de baixa umidade. Essa técnica permite o monitoramento longitudinal de vários parâmetros fisiológicos, incluindo atividade estimulada, atividade não estimulada, tamanho corporal, geometria do movimento, tempo de saúde e sobrevivência, em um ambiente semelhante à técnica padrão para cultura de grupo em meios sólidos em placas de Petri. Este método é compatível com a coleta de dados de alto rendimento quando usado em conjunto com software de microscopia e análise automatizados. Finalmente, as limitações desta técnica são discutidas, bem como uma comparação desta abordagem com um método recentemente desenvolvido que utiliza microbandejas para cultura de nematoides isolados em meio sólido.
Introduction
Caenorhabditis elegans são comumente usados em estudos de envelhecimento devido ao seu curto tempo de geração (aproximadamente 3 dias), curta expectativa de vida (aproximadamente 3 semanas), facilidade de cultivo em laboratório, alto grau de conservação evolutiva de processos moleculares e vias com mamíferos, e ampla disponibilidade de técnicas de manipulação genética. No contexto dos estudos de envelhecimento, C. elegans permite a geração rápida de dados de longevidade e populações envelhecidas para a análise de fenótipos tardios em animais vivos. A abordagem típica para a realização de estudos de envelhecimento de vermes envolve a medição manual da vida útil de uma população de vermes mantida em grupos de 20 a 70 animais em meios de crescimento de nematoides em ágar sólido (NGM) em placas de Petri de 6 cm1. O uso de populações sincronizadas com a idade permite a medição da expectativa de vida ou fenótipos transversais em animais individuais em toda a população, mas esse método impede o monitoramento das características de animais individuais ao longo do tempo. Essa abordagem também é trabalhosa, restringindo o tamanho da população que pode ser testada.
Há um número limitado de métodos de cultura que permitem o monitoramento longitudinal de C. elegans individuais ao longo de sua vida útil, e cada um tem um conjunto distinto de vantagens e desvantagens. Dispositivos microfluídicos, incluindo WormFarm2, NemaLife3, chipde “comportamento” 4, entre outros 5,6,7, permitem o monitoramento de animais individuais ao longo do tempo. O cultivo de vermes em cultura líquida utilizando placas de poços múltiplos permite o monitoramento de animais individuais ou de pequenas populações de C. elegans ao longo do tempo 8,9. O ambiente líquido representa um contexto ambiental distinto do ambiente comum de cultura em meio sólido em placas de Petri, o que pode alterar aspectos da fisiologia animal relevantes para o envelhecimento, incluindo o conteúdo de gordura e a expressão de genes de resposta ao estresse10,11. A capacidade de comparar diretamente esses estudos com a maioria dos dados coletados sobre envelhecimento de C. elegans é limitada por diferenças em variáveis ambientais potencialmente importantes. O Worm Corral12 é uma abordagem desenvolvida para abrigar animais individuais em um ambiente que replica mais de perto a cultura típica de mídia sólida. O Curral de Vermes contém uma câmara selada para cada animal em uma lâmina de microscópio utilizando hidrogel, permitindo o monitoramento longitudinal dos animais isolados. Esse método usa imagens de campo claro padrão para registrar dados morfológicos, como tamanho e atividade corporal. No entanto, os animais são colocados no ambiente de hidrogel como embriões, onde permanecem intactos durante toda a sua vida. Isso requer o uso de fundos genéticos mutantes ou transgênicos condicionalmente estéreis, o que limita tanto a capacidade de triagem genética, já que cada nova mutação ou transgene precisa ser cruzado em um fundo com esterilidade condicional, quanto a capacidade de triagem de drogas, já que os tratamentos só podem ser aplicados uma vez aos animais como embriões.
Um método alternativo desenvolvido pelo laboratório Fang-Yen permite o cultivo de vermes em meio sólido em poços individuais de um dispositivo microfabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) denominado WorMotel13,14. Cada dispositivo é colocado em uma bandeja de poço único (ou seja, com as mesmas dimensões de uma placa de 96 poços) e tem 240 poços separados por um fosso preenchido com uma solução aversiva para evitar que os vermes viajem entre poços. Cada poço pode abrigar um único verme durante toda a sua vida útil. O dispositivo é cercado por pastilhas de gel de poliacrilamida absorvedoras de água (conhecidas como “cristais de água”), e a bandeja é selada com filme de laboratório Parafilm para manter a umidade e minimizar a dessecação do meio. Esse sistema permite que dados de saúde e expectativa de vida sejam coletados para animais individuais, enquanto o uso de meios sólidos recapitula melhor o ambiente experimentado pelos animais na grande maioria dos estudos publicados sobre a expectativa de vida de C. elegans, permitindo comparações mais diretas. Recentemente, uma técnica semelhante foi desenvolvida utilizando microbandejas de poliestireno que foram originalmente usadas para ensaios de microcitotoxicidade15 no lugar do dispositivo PDMS16. O método da microbandeja permite a coleta de dados individualizados para vermes cultivados em meio sólido e melhorou a capacidade de conter vermes em condições que normalmente causariam fuga (por exemplo, estressores ou restrição alimentar), com a compensação de que cada microbandeja pode conter apenas 96 animais16, enquanto o dispositivo multipoço utilizado aqui pode conter até 240 animais.
Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a preparação de dispositivos multipoços que é otimizado para consistência placa a placa e a preparação de vários dispositivos em paralelo. Esse protocolo foi adaptado do protocolo original do laboratório Fang-Yen13. Especificamente, há descrições de técnicas para minimizar a contaminação, otimizar a secagem consistente do meio sólido e da fonte de alimento bacteriano e entregar RNAi e medicamentos. Esse sistema pode ser usado para rastrear a saúde individual, a expectativa de vida e outros fenótipos, como tamanho e forma do corpo. Esses dispositivos de vários poços são compatíveis com sistemas de alto rendimento existentes para medir a vida útil, o que pode remover grande parte do trabalho manual envolvido em experimentos tradicionais de vida útil e fornecer a oportunidade de medição de longevidade direta e automatizada e rastreamento de saúde em C. elegans individuais em escala.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema WorMotel é uma ferramenta poderosa para coletar dados individualizados para centenas de C. elegans isolados ao longo do tempo. Seguindo os estudos anteriores usando dispositivos multipoços para aplicações em quiescência de desenvolvimento, comportamento locomotor e envelhecimento, o objetivo deste trabalho foi otimizar a preparação de dispositivos multipoços para o monitoramento de longo prazo da atividade, saúde e vida útil de uma maneira de maior rendimento. Este trabalho fornece um protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R35GM133588 para G.L.S., um Prêmio Catalisador da Academia Nacional de Medicina dos Estados Unidos para G.L.S., o Fundo de Iniciativa de Tecnologia e Pesquisa do Estado do Arizona administrado pelo Conselho de Regentes do Arizona e a Fundação Médica Ellison.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
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