在固体培养基上长期培养单个 秀丽隐杆线虫 ，用于纵向荧光监测和厌恶干预
Summary
在这里，我们提出了一种在固体培养基上培养分离的单个线虫的协议，用于终身生理参数跟踪和荧光定量。该培养系统包括单虫孔周围的棕榈酸屏障，以防止动物逃跑，允许使用厌恶性干预措施，包括致病细菌和化学应激源。
Abstract
秀丽隐杆线虫 被广泛用于研究衰老生物学。 秀丽隐杆 线虫衰老研究的标准做法是在固体线虫生长培养基（NGM）上培养蠕虫群，从而可以有效地收集存活和其他生理表型的种群水平数据，并定期对亚群进行采样以进行荧光生物标志物定量。这种方法的局限性在于无法（1）随着时间的推移跟踪单个蠕虫，以开发感兴趣的表型的年龄轨迹，以及（2）直接在培养环境中监测荧光生物标志物。替代培养方法使用液体培养或微流体来监测单个动物随时间的变化，在某些情况下包括荧光定量，但代价是培养环境在上下文中与固体NGM不同。WorMotel是前面描述的微加工多孔装置，用于在固体NGM上培养分离的蠕虫。每条蠕虫都保存在含有固体NGM的井中，周围环绕着充满硫酸铜的护城河，硫酸铜是 秀丽隐杆线虫的接触驱虫剂，可以对个体动物进行纵向监测。我们发现硫酸铜不足以防止蠕虫在受到衰老研究中常见的厌恶性干预时逃跑，包括饮食限制、致病菌和诱导细胞应激的化学制剂。多孔设备也由聚二甲基硅氧烷模制而成，在荧光成像中会产生高背景伪影。该协议描述了一种使用市售聚苯乙烯微托盘在固体NGM上培养分离蛔虫的新方法，最初设计用于人白细胞抗原（HLA）分型，允许在整个生命周期内测量存活，生理表型和荧光。棕榈酸屏障可防止蠕虫逃跑，即使在存在厌恶条件的情况下也是如此。每个平板可以培养多达 96 只动物，并轻松适应各种条件，包括饮食限制、RNAi 和化学添加剂，并与用于收集寿命和活动数据的自动化系统兼容。
Introduction
秀丽隐杆线虫是遗传学、细胞生物学和分子生物学研究的强大模式生物，因为它们易于在实验室中培养，生成时间和寿命短，与哺乳动物共享高度的蛋白质同源性，并且具有透明的身体结构，可以对荧光蛋白和染料进行体内可视化1。由于秀丽隐杆线虫在包括发育生物学和衰老在内的一系列领域长期使用作为主要模型系统，它们的生长和发育得到了很好的理解，它们的基因组已经完全测序，并且已经创建了一系列强大的遗传工具，包括全基因组RNAi喂养文库和数千种突变和转基因菌株。从历史上看，秀丽隐杆线虫在固体琼脂线虫生长培养基（NGM）上作为种群培养，并且通过直接观察或通过成像和下游分析手动评估表型。荧光显微镜用于在单个秀丽隐杆线虫中使用染料或转基因表达的荧光标签捕获各种分子表型。荧光成像通常涉及在含有薄琼脂糖垫的载玻片上固定或麻痹动物，这是侵入性的，通常是致命的。它还涉及使用化学品，例如左旋咪唑或叠氮化钠，这可能会干扰感兴趣的分子过程2，3。总之，这些方法允许在广泛的表型中收集横断面，种群水平的数据，但不允许随着时间的推移跟踪单个动物。
近年来，出现了几种培养分离秀丽隐杆线虫的方法，使研究人员能够利用新的成像技术捕获动物生理和分子表型随时间变化的动态变化。一类秀丽隐杆线虫培养方法是微流体装置，包括WormFarm4，Nemalife芯片5和Chronis等人的“行为”芯片6，以及其他各种7，8，9。与此相关的是基于液体的培养方法，该方法使用多孔板来表征单个蠕虫或随时间变化的小种群10，11。微流体和微孔板系统可以对秀丽隐杆线虫到单个动物的表型反应进行出色的定量测量，但培养环境存在关键限制。过去对秀丽隐杆线虫的绝大多数研究，特别是在衰老领域，都是在固体琼脂基培养基上完成的。液体培养使秀丽隐杆线虫不断游泳，并代表了一种独特的环境背景，可以改变潜在的生物学。例如，与在琼脂基固体NGM12，13上培养的动物相比，在液体培养基培养基中培养的动物具有显着改变的脂肪含量和基因表达 – 特别是对于参与应激反应的基因。另一类单一动物成像方法涉及在固体培养基上分离单个动物的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，以更紧密地模拟在培养皿上的群体培养中在固体NGM上培养的蠕虫所经历的标准环境。WorMotel是一款240孔PDMS设备，设计用于在固体培养基上培养个体动物。每个孔都填充使用低熔点琼脂糖代替琼脂的改良NGM，并接种细菌食物，形成类似于使用培养皿的最常见培养系统的固体培养基环境。井壁是圆形的，无论在孔中的位置如何，都可以对每只动物进行成像（避免多孔板中动物靠近壁造成的视觉遮挡）。每口井周围狭窄护城河中的硫酸铜被用作威慑动物在井中14，15。这种方法的局限性在于，当存在厌恶的环境条件（包括饮食限制、致病菌或诱发细胞应激的化学物质（例如百草枯））时，硫酸铜无法有效防止蠕虫逃跑。
第二个使用固体介质的系统是蠕虫畜栏，它采用水凝胶为载玻片上的每条蠕虫创建一个小型密封环境，允许对单独分离的动物进行长期监测16。一个关键的限制是动物必须作为卵子密封在环境中，需要使用不育动物来防止繁殖，并将药物治疗限制在单一应用。多剂量药物试验可以在WorMotel中完成，方法是在将蠕虫转移到设备之前进行多露，或者在实验期间向孔中局部添加其他药物;然而，在后一种情况下，向现有孔中添加额外药物后的实际暴露剂量难以精确量化，并且取决于药物降解的速度。WorMotel和Worm Corral都非常适合明场或暗场成像，以捕获与活动和动物生理学（例如生长和发育）相关的信息。虽然这些系统可用于监测荧光，但根据我们的经验，用于创建其他单虫成像技术的PDMS容易形成微泡，捕获颗粒和其他小异常，产生不规则的荧光伪影，干扰一致的荧光可视化和定量，特别是在GFP的发射范围内，GFP是 秀丽隐杆线虫 研究中最常用的荧光团。迄今为止， 秀丽隐杆线虫 个体动物的纵向实时荧光成像主要依赖于微流体装置17。
在这里，我们描述了一种在固体培养基上培养单个 秀丽隐杆线虫 的新方法，该方法与厌恶干预和直接荧光成像兼容。这种方法在概念上与其他单蠕虫成像技术相似，只是定制模制的PDMS芯片被最初为微细胞毒性测定开发的市售聚苯乙烯微托盘（通常也称为寺崎托盘）所取代18。这些微托盘具有可以填充固体培养基并接种细菌食物的孔，与标准固体NGM培养方法下的动物所经历的环境非常相似。每口井都被棕榈酸而不是硫酸铜的厌恶屏障包围。棕榈酸通常用于防止蠕虫逃离固体培养基，在实验中使用培养皿上的标准组培养物，其中蠕虫受到厌恶环境（如饮食限制或暴露于化学应激源）的挑战。微托盘还产生最小且一致的荧光背景，允许直接在动物的培养环境中对动物进行荧光成像。这种基于琼脂的新型单动物固体培养系统不仅可以跟踪个体动物的整个生命并监测生长、发育、活动和寿命，而且还与直接荧光显微镜兼容。由于蠕虫可以在没有麻痹或固定的情况下成像，因此可以在留在培养基上的个体动物中纵向量化体内荧光生物标志 物，从而 可以观察每只动物一生中的动态变化。该培养系统还与用于跟踪寿命和其他健康指标的当前一代自动化系统兼容14，19。我们提供了在这个基于微托盘的系统中培养单个 秀丽隐杆线虫 的详细协议，讨论了潜在的陷阱和故障排除，并讨论了相对于其他系统的优势和局限性，特别是更新和优化的WorMotel协议15。
每个单虫培养环境由一个微型托盘组成，该微托盘使用定制的3D打印适配器安装在标准单孔托盘内（图1A）。孔中充满低熔点琼脂糖线虫生长培养基（lmNGM），接种浓缩细菌作为食物来源，并被棕榈酸涂层包围以防止蠕虫逃跑（图1B）。微托盘和单孔板壁之间的空间充满饱和水晶体以保持湿度（图1B）。在托盘盖上涂上洗涤剂涂层以防止冷凝。每个孔中加入一个蠕虫，单孔托盘用石蜡膜密封以保持水分并允许氧气交换。一个经验丰富的研究人员可以合理地并行制备多达六个微量托盘。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了一种新的培养系统，该系统适应最初为人类白细胞抗原组织分型测定开发的微托盘，以允许在固体培养基环境中随着时间的推移分离和表征单个 秀丽隐杆 线虫，该环境在上下文中类似于基于琼脂的NGM，这是 秀丽隐杆线虫 研究的标准。该系统与各种干预措施兼容，包括饮食限制、外源性药物治疗、化学或环境压力源的挑战以及 RNAi。它进一步允许纵向监测个体 <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH R35GM133588对GLS，NIHT32GM008659培训补助金给L.E.的支持，美国国家医学院催化剂奖给GLS，以及亚利桑那州技术和研究计划基金由亚利桑那州董事会管理。
Materials
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
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