Een microfluïdisch platform om bioclogging in poreuze media te bestuderen
Summary
Het huidige protocol beschrijft een microfluïdisch platform om de ontwikkeling van biofilms in quasi-2D poreuze media te bestuderen door microscopiebeeldvorming met hoge resolutie te combineren met gelijktijdige drukverschilmetingen. Het platform kwantificeert de invloed van poriegrootte en vloeistofstroomsnelheden in poreuze media op bioclogging.
Abstract
Bacteriële biofilms worden aangetroffen in verschillende milieu- en industriële poreuze media, waaronder bodems en filtratiemembranen. Biofilms groeien onder bepaalde stromingsomstandigheden en kunnen de poriën verstoppen, waardoor de lokale vloeistofstroom wordt omgeleid. Het vermogen van biofilms om poriën te verstoppen, de zogenaamde bioclogging, kan een enorm effect hebben op de lokale permeabiliteit van het poreuze medium, waardoor een drukopbouw in het systeem ontstaat en de massastroom erdoorheen wordt beïnvloed. Om de wisselwerking tussen biofilmgroei en vloeistofstroom onder verschillende fysieke omstandigheden (bijvoorbeeld bij verschillende stroomsnelheden en poriegroottes) te begrijpen, wordt in deze studie een microfluïdisch platform ontwikkeld om de ontwikkeling van biofilms te visualiseren met behulp van een microscoop onder extern opgelegde, gecontroleerde fysieke omstandigheden. De door de biofilm geïnduceerde drukopbouw in het poreuze medium kan gelijktijdig worden gemeten met behulp van druksensoren en later worden gecorreleerd met de oppervlaktedekking van de biofilm. Het gepresenteerde platform biedt een basis voor een systematische aanpak om bioclogging veroorzaakt door biofilms in poreuze media onder stromingsomstandigheden te onderzoeken en kan worden aangepast aan het bestuderen van omgevingsisolaten of biofilms met meerdere soorten.
Introduction
Biofilms – bacteriekolonies ingebed in een zelfuitgescheiden matrix van extrapolymere stoffen (EPS) – zijn alomtegenwoordig in natuurlijke poreuze media, zoals bodems en watervoerende lagen1, en technische en medische toepassingen, zoals bioremediatie2, waterfiltratie3 en medische hulpmiddelen4. De biofilmmatrix bestaat uit polysacchariden, eiwitvezels en extracellulair DNA5,6 en is sterk afhankelijk van de micro-organismen, de beschikbaarheid van voedingsstoffen en de omgevingscondities7. Toch zijn de functies van de matrix universeel; Het vormt de steiger van de biofilmstructuur, beschermt de microbiële gemeenschap tegen mechanische en chemische spanningen en is grotendeels verantwoordelijk voor de reologische eigenschappen van de biofilms5.
In poreuze media kan de groei van biofilms de poriën verstoppen, waardoor de zogenaamde bioclogging ontstaat. De ontwikkeling van biofilms wordt geregeld door de vloeistofstroom en poriegrootte, gedefinieerd als de afstand tussen twee pilaren, van het poreuze medium 8,9,10. Zowel de poriegrootte als de vloeistofstroom regelen het transport van voedingsstoffen en lokale schuifkrachten. Op zijn beurt verstopt de groeiende biofilm de poriën, wat de snelheidsverdeling van de vloeistof 11,12,13, het massatransport en de hydraulische geleidbaarheid van het poreuze medium beïnvloedt 14,15. De veranderingen in hydraulische geleidbaarheid worden weerspiegeld door verhoogde druk in gesloten systemen16,17,18,19. Huidige microfluïdische studies in biofilmontwikkeling en bioclogging richten zich op het bestuderen van de impact van stroomsnelheden in homogene geometrieën16,20 (d.w.z. met een enkelvoudige poriegrootte) of heterogene poreuze media12,21,22. Om echter de effecten van stroomsnelheden en poriegrootte op de ontwikkeling van biofilms en de daaruit voortvloeiende drukveranderingen in het bioclogeerde poreuze medium te ontwarren, is een zeer controleerbaar en veelzijdig experimenteel platform nodig dat de studie van verschillende poreuze mediageometrieën en omgevingscondities parallel mogelijk maakt.
De huidige studie introduceert een microfluïdisch platform dat drukmetingen combineert met gelijktijdige beeldvorming van de evoluerende biofilm in het poreuze medium. Vanwege de gasdoorlaatbaarheid, biocompatibiliteit en flexibiliteit in het kanaalgeometrieontwerp, is een microfluïdisch apparaat gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) een geschikt hulpmiddel voor het bestuderen van biofilmontwikkeling in poreuze media. Microfluïdica maken het mogelijk om de fysische en chemische omstandigheden (bijv. vloeistofstroom en nutriëntenconcentratie) met hoge precisie te beheersen om de omgeving van microbiële habitats na te bootsen23. Verder kunnen microfluïdische apparaten eenvoudig worden afgebeeld met micrometrische resolutie met behulp van een optische microscoop en gekoppeld aan online metingen (bijvoorbeeld de lokale druk).
In dit werk richten de experimenten zich op het bestuderen van de impact van poriegrootte in een homogeen poreus medium analoog onder gecontroleerde opgelegde stromingsomstandigheden. De stroom van een kweekmedium wordt opgelegd met behulp van een spuitpomp en het drukverschil door het microfluïdische kanaal wordt gelijktijdig gemeten met druksensoren. Biofilmontwikkeling wordt geïnitieerd door het zaaien van een planktoncultuur van Bacillus subtilis in het microfluïdische kanaal. Regelmatige beeldvorming van de evoluerende biofilm en beeldanalyse maakt het mogelijk om porieschaal opgeloste informatie over de oppervlaktedekking onder verschillende experimentele omstandigheden te verkrijgen. De gecorreleerde informatie over drukverandering en de mate van bioclogging levert cruciale input voor permeabiliteitsschattingen van bioclogged poreuze media.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluïdische poreuze media-analogen in combinatie met druksensoren bieden een geschikt hulpmiddel om de ontwikkeling van biofilms in poreuze media te bestuderen. De veelzijdigheid in het ontwerp van het microfluïdische poreuze medium, met name de opstelling van de pilaren, inclusief diameter, onregelmatige vormen en poriegrootte, maakt het mogelijk om vele geometrieën te onderzoeken. Deze geometrieën variëren van enkele poriën tot zeer complexe, onregelmatig gerangschikte obstakels die verschillende natuurlijke …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van SNSF PRIMA grant 179834 (aan E.S.), discretionaire financiering van ETH (aan R.S.), ETH Zurich Research Grant (aan R.S. en J.J.M.), en discretionaire financiering van Eawag (aan J.J.M.). De auteurs willen Roberto Pioli bedanken voor het illustreren van de experimentele opstelling in figuur 1B en Ela Burmeister voor het siliciumwaferpreparaat.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
