Dosage vert de malachite pour la découverte d’inhibiteurs de la protéine 90 de choc thermique
Summary
Le protocole de dosage vert malachite est une méthode simple et rentable pour découvrir les suppresseurs de la protéine de choc thermique 90 (Hsp90), ainsi que d’autres composés inhibiteurs contre les enzymes dépendantes de l’ATP.
Abstract
La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est une cible anticancéreuse prometteuse en raison de son effet chaperonnant sur de multiples protéines oncogènes. L’activité de Hsp90 dépend de sa capacité à hydrolyser l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine diphosphate (ADP) et phosphate libre. L’activité ATPase de Hsp90 est liée à sa fonction chaperonnante ; L’ATP se lie au domaine N-terminal du Hsp90, et la perturbation de sa liaison s’est avérée être la stratégie la plus efficace pour supprimer la fonction Hsp90. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par un dosage colorimétrique du vert malachite, qui détermine la quantité de phosphate libre formée par hydrolyse de l’ATP. Ici, une procédure pour déterminer l’activité ATPase de la levure Hsp90 en utilisant le kit de dosage de phosphate vert malachite est décrite. En outre, des instructions détaillées pour la découverte d’inhibiteurs de Hsp90 en prenant de la geldanamycine comme inhibiteur authentique sont fournies. Enfin, l’application de ce protocole de dosage par le criblage à haut débit (HTS) de molécules inhibitrices contre la levure Hsp90 est discutée.
Introduction
La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est un chaperon moléculaire qui maintient la stabilité des protéines responsables du développement et de la progression du cancer. De plus, les protéines responsables du développement de la résistance aux agents antinéoplasiques sont également clientes de Hsp901. Hsp90 est surexprimé de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules cancéreuses (>90% des protéines cellulaires), par rapport aux cellules normales où il peut constituer moins de 2% des protéines totales. De plus, le Hsp90 des cellules cancéreuses réside dans un complexe avec des co-chaperons, alors que dans une cellule normale, il est présent principalement à l’état libreet non complexé 2,3. Au cours des dernières années, il a été démontré que plusieurs inhibiteurs de Hsp90 possèdent des effets sénolytiques dans des études in vitro et in vivo, où ils ont considérablement amélioré la durée de vie des souris 4,5,6. Tous les résultats susmentionnés corroborent le fait que les inhibiteurs de Hsp90 pourraient être efficaces dans plusieurs types de cancer, avec moins d’effets indésirables et moins de risques de développer une résistance. La fonction chaperonnante de Hsp90 est accomplie en liant l’ATP au domaine N-terminal de Hsp90 et en l’hydrolysant en ADP et en phosphate libre7. De petites molécules qui se lient de manière compétitive à la poche de liaison ATP de Hsp90 se sont avérées supprimer avec succès l’effet chaperonnant de la protéine. À ce jour, cela reste la meilleure stratégie pour l’inhibition de Hsp90, ce qui est soutenu par le fait que ces inhibiteurs ont atteint les essais cliniques8. L’un d’eux, Pimitespib, a été approuvé au Japon pour le traitement de la tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) en juin 20229. Il s’agit du premier inhibiteur de Hsp90 approuvé depuis que la pharmacogabilité du chaperon a été établie en 199410.
Le dosage vert malachite est une procédure simple, sensible, rapide et peu coûteuse pour la détection du phosphate inorganique, adaptée à l’automatisation et au criblage à haut débit (HTS) de composés par rapport à sa ciblesouhaitée 11. Le test a été utilisé avec succès pour le criblage des inhibiteurs de Hsp90 dans de petites installations à l’échelle du laboratoire, ainsi que dans un HTS 12,13,14,15,16,17. Le test utilise une méthode colorimétrique qui détermine le phosphate inorganique libre formé en raison de l’activité ATPase de Hsp90. La base de cette quantification est la formation d’un complexe phosphomolybdate entre le phosphate libre et le molybdène, qui réagit ensuite avec le vert malachite pour générer une couleur verte (Figure 1). Cette formation rapide de couleur est mesurée sur un spectrophotomètre, ou sur un lecteur de plaques, entre 600-660 nm18,19.
Dans le présent protocole, la procédure à suivre pour effectuer un dosage au vert de malachite avec la levure Hsp90 et l’identification ultérieure des inhibiteurs contre le chaperon sont décrites. La molécule de produit naturel, la geldanamycine (GA), avec laquelle la pharmacogabilité de Hsp90 a été établie pour la première fois, a été prise comme inhibiteur authentique10. HTS est devenu une partie intégrante du programme actuel de découverte de médicaments, en raison de la disponibilité d’un grand nombre de molécules pour les tests. Cette technique a gagné en importance au cours des 2 dernières années en raison du besoin urgent de réorienter les médicaments pour traiter l’infection Covid-1920,21. Par conséquent, un aperçu détaillé de l’HTS des molécules contre la protéine de levure Hsp90 en adoptant la méthode de dosage vert malachite est présenté.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 est une cible importante pour la découverte de nouvelles molécules médicamenteuses anticancéreuses. Depuis que sa pharmacogabilité a été établie en 199410, 18 molécules ont atteint les essais cliniques. À l’heure actuelle, sept molécules sont en phase variable d’essais cliniques, seules ou en combinaison22. Toutes ces petites molécules sont des inhibiteurs de liaison à l’ATP N-terminal. Les autres moyens d’inhibition du chaperon (inhibiteurs C-ter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le programme Korea Research Fellowship (KRF), boursier postdoctoral de la National Research Foundation of Korea (NRF), financé par le ministère des Sciences et des TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Les auteurs remercient la subvention intra-muros du KIST et la subvention numéro 2MRB130 du ministère des Océans et des Pêches pour l’aide financière qu’ils ont apportée à ce projet.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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