Differentiering af funktionelle osteoklaster fra humant perifert blod CD14+ monocytter

Summary

Osteoklaster er vigtige knogleresorberende celler i kroppen. Denne protokol beskriver en pålidelig metode til in vitro-differentiering af osteoklaster fra humane perifere blodmonocytter. Denne metode kan bruges som et vigtigt redskab til yderligere at forstå osteoklastbiologi i homeostase og i sygdomme.

Abstract

Osteoklaster (OC’er) er knogleresorberende celler, der spiller en afgørende rolle i skeletudvikling og voksen knoglemodellering. Flere knoglesygdomme skyldes øget differentiering og aktivering af OC’er, så hæmningen af denne patobiologi er et centralt terapeutisk princip. To nøglefaktorer driver differentieringen af OC’er fra myeloide forløbere: makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B-ligand (RANKL). Human cirkulerende CD14⁺ monocytter har længe været kendt for at differentiere sig til OC’er in vitro. Eksponeringstiden og koncentrationen af RANKL påvirker imidlertid differentieringseffektiviteten. Faktisk er protokoller for generering af humane OC’er in vitro blevet beskrevet, men de resulterer ofte i en dårlig og langvarig differentieringsproces. Heri leveres en robust og standardiseret protokol til generering af funktionelt aktive modne humane OC’er rettidigt. CD14⁺ monocytter er beriget fra humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) og primet med M-CSF for at opregulere RANK. Efterfølgende eksponering for RANKL genererer OC’er på en dosis- og tidsafhængig måde. OC’er identificeres og kvantificeres ved farvning med tartratsyreresistent fosfatase (TRAP) og lysmikroskopianalyse. Immunofluorescensfarvning af kerner og F-actin bruges til at identificere funktionelt aktive OC’er. Derudover beriges OSCAR ⁺ CD14-modne OC’er yderligere via flowcytometricellesortering og ^{OC-funktionalitet} kvantificeret ved mineralske (eller dentin/knogle) resorptionsassays og actinringdannelse. Endelig anvendes en kendt OC-hæmmer, rotenon, på modne OC’er, hvilket viser, at adenosintrifosfat (ATP) produktion er afgørende for actinringintegritet og OC-funktion. Afslutningsvis etableres et robust assay til differentiering af et stort antal OC’er i dette arbejde, som i kombination med actinringfarvning og et ATP-assay giver en nyttig in vitro-model til evaluering af OC-funktion og til screening for nye terapeutiske forbindelser, der kan modulere differentieringsprocessen.

Introduction

Osteoklaster (OC’er) er multinucleated gigantiske celler af hæmatopoietisk afstamning med en unik evne til at resorbere knogle. De er ansvarlige for udvikling og kontinuerlig ombygning af skelettet ^1,2. I skeletfaserne af udvikling er OC’er og vævsresidente makrofager afledt af erythro-myeloide forfædre og koloniserer knoglenichen og organvævet. Under fysiologiske forhold kræves erythro-myeloide forfædre til normal knogleudvikling og tandudbrud, mens tilstrømningen af cirkulerende blodmonocytter ind i knoglenichen giver postnatal vedligeholdelse af OC’erne, knoglemasse og knoglemarvshulrum³. Under patologiske tilstande rekrutteres monocytter til steder med aktiv inflammation og kan bidrage til patologisk knogledestruktion ^4,5.

Patienter med flere former for gigt oplever ledbetændelse, hvilket fører til progressiv fælles ødelæggelse forårsaget af OC’er⁶. For eksempel i reumatoid arthritis (RA) er overaktiverede OC’er ansvarlige for patologisk knogleerosion og ledødelæggelse ^7,8, og nuværende behandlinger forbedrer eller stopper ofte ikke knogleskaden^9,10,11. Ændringer i cirkulerende monocytter både med hensyn til populationsfordeling og transkriptomiske og epigenetiske signaturer er blevet rapporteret hos RA-patienter^12,13,14. Desuden er det blevet rapporteret, at ændrede monocytresponser på inflammatorisk stimulering påvirker osteoklastogenese hos RA-patienter med aktiv sygdom^15,16,17.

Differentieringen af OC’er er en kompleks flertrinsproces, der omfatter forpligtelsen af myeloide forløberceller til differentiering i OC-prækursorer. Under osteoklastogenese bliver OC’er gigantiske og multinucleated gennem cellecellefusion, ufuldstændig cytokinese og en nuklear genanvendelsesproces beskrevet som fission og fusion^18,19,20. Evnen til at differentiere OC’er in vitro har muliggjort betydelige fremskridt i forståelsen af knoglebiologi²¹. OC’er adskiller sig fra forstadier ved eksponering for makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B-ligand (RANKL). Sidstnævnte er afgørende for den normale udvikling og funktion af OC’er in vitro og in vivo, selv under inflammatoriske tilstande 6,22,23. RANKL præsenteres af osteoblaster og osteocytter såvel som af aktiverede T-celler og fibroblaster i det betændte RA-synovium 2,24,25. Under OC-differentieringsprocessen opregulerer monocytter udsat for M-CSF receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B (RANK) ekspression på deres cellemembran og differentieres under efterfølgende stimulering med RANKL til tartratresistente syrephosphatase (TRAP)-positive mononukleære præ-OC’er og derefter til multinucleated OC’er^15,26. OC’er producerer flere enzymer, hvoraf den vigtigste er TRAP, som muliggør nedbrydning af phosphoproteiner i knogle²⁷. En regulator og markør for OC-differentiering er den OC-associerede receptor (OSCAR). Det opreguleres tidligt i forløberceller, der forpligter sig til OC-slægten²⁸. Modne gigantiske multinucleated OC’er kan nedbryde (resorbere) skeletmatrixen ved at generere en stor tætningszone, som er lavet af en actinring, der omgiver en flæsekant^21,29,30. OC’ernes knogleresorptionsevne kræver cytoskeletomorganisering og den deraf følgende polarisering og dannelse af en indviklet membran, som er den såkaldte ruffled border. Den flæsede kant er omgivet af et stort cirkulært bånd af en F-actinrig struktur, som er actinringen eller forseglingszonen. Actinringintegritet er afgørende for, at OC’er kan resorbere knogle både in vitro og in vivo, og defekt ruffled grænsedannelse er forbundet med lavere vakuolær adenosintrifosfatase (V-ATPase) ekspression^31,32,33. Desuden er OC’er mitokondrierrige celler, og adenosintrifosfat (ATP) associerer med mitokondrielignende strukturer i OC’er lokaliseret ved den ruffled grænse^31,32,33. Rotenon virker som en stærk hæmmer af mitokondriekomplekset I og påvirker ATP-produktionen. Rotenon har også vist sig at hæmme OC-differentiering og funktion³⁴.

Denne protokol beskriver en effektiv og optimeret metode til in vitro osteoklastogenese fra humane perifere blodprøver. I humant perifert blod er CD14 ⁺ monocytter den vigtigste kilde til OC’er^15,35,36. I denne protokol er eksponeringskinetikken og koncentrationerne af M-CSF og RANKL blevet justeret for optimal osteoklastogenese. Mononukleære celler adskilles først fra erytrocytterne og granulocytterne, der er til stede i fuldblod ved densitetsgradient; de beriges derefter til CD14⁺ monocytter ved hjælp af positiv selektion af magnetiske perler. De isolerede CD14⁺ monocytter inkuberes derefter natten over med M-CSF. Dette primer monocytterne for at opregulere ekspressionen af RANK^15,26. Den efterfølgende tilsætning af RANKL inducerer osteoklastogenese og multinucleation på en tidsafhængig måde. Aktiv-resorberende OC’er viser den karakteristiske fordeling af F-actinringe ved kanten af cellemembranen^30,32 og farvning for TRAP. Modne OC’er analyseres ved at kvantificere TRAP⁺ multinucleated (mere end tre kerner) celler. Den funktionelle kapacitet hos modne OC’er kan vurderes ud fra deres resorption, aktinringintegritet og ATP-produktion. Desuden kan differentierede CD14-OSCAR ⁺ OC’er beriges og bruges til at vurdere virkningerne af visse forbindelser på OC-funktionalitet via mineral (eller dentin) resorption og ^{F-actinorganisation}. Derudover anvendes en kendt OC-hæmmer, rotenon, i dette arbejde som et eksempel på en forbindelse, der påvirker funktionaliteten af OC’er. Reduceret OC-resorptionsaktivitet under rotenon er forbundet med reduceret ATP-produktion og aktinringfragmentering. Afslutningsvis etablerer denne protokol et robust assay, der kan bruges som referencemetode til at studere flere biologiske aspekter af OC-differentiering og funktion in vitro.

Denne metode kan bruges til at vurdere (1) potentialet for cirkulerende monocytter til at differentiere sig til OC’er i sundhed og sygdomme samt (2) virkningen af terapeutiske kandidater på OC-differentiering og funktion. Denne robuste osteoklastogeneseprotokol muliggør bestemmelse af effektiviteten og mekanismerne for knoglemålrettede terapier på både OC-differentiering fra forløberceller og funktionen af modne OC’er.

Protocol

Buffy coats opnået fra Scottish National Blood Transfusion Service (Edinburgh) og leukocytkegler opnået fra NHS Blood and Transplant (Newcastle) leveres til University of Glasgow forskere i en fuldt anonymiseret (ikke-identificerbar) form fra fuldt samtykkende NHS-bloddonorer. Buffy frakke og leukocytkegle blodkomponenter er fremstillet af en NHS standard bloddonation givet på et NHS bloddonorcenter i Skotland eller England. Bloddonoren giver informeret samtykke på tidspunktet for bloddonationen til overskydende blod, der ikke anvendes i standard NHS klinisk praksis, til brug for godkendte medicinske forskningsundersøgelser. Den etiske godkendelse fra NHS Research Ethics Committee og de underskrevne donorsamtykkeformularer til at bruge disse bloddonationer opbevares af NHS-bloddonationstjenesten. Godkendelse til at få adgang til og bruge disse samtykkede bloddonationer i godkendte medicinske forskningsundersøgelser blev søgt og opnået ved hjælp af standard intern ansøgning og gennemgangsproces fra National Blood Transfusion Service (Skotland) og NHS Blood and Transport (England). Der var ikke behov for yderligere NHS REC-godkendelse eller godkendelse fra det etiske udvalg ved University of Glasgow for at bruge blodkomponenterne til de godkendte medicinske forskningsundersøgelser. 1. Generelle bemærkninger inden påbegyndelse Fortsæt med alt arbejde med blod med forsigtighed. Overvej de potentielle farer ved forskellige infektiøse agenser, der kan være til stede i prøverne. Udfør alt arbejdet forsigtigt i biosikkerhedslaboratoriet under sterile forhold, mens du bærer handsker og laboratoriefrakker. Udfør bortskaffelse af biosikkerhed i henhold til de lokale retningslinjer. Indhent passende samtykke og etiske godkendelser inden prøveindsamling i henhold til lokale myndigheders regler. Generelt vil 1 ml frisk blod give 1 million PBMC’er, og CD14 + monocytter tegner sig for ca. 10% -30% af PBMC’erne. Til sammenligning kan 10 ml leukocytkegle indeholde 5 x 10 8-15 x 108 PBMC’er. For yderligere oplysninger om PBMC-isolering henvises til en tidligere protokol37. 2. Dyrkning af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) fra fuldblod Saml den nødvendige mængde frisk blod fra raske donorer i lithiumheparinopsamlingsrør.BEMÆRK: Andre opsamlingsrør med passende antikoagulantia kan også anvendes (f.eks. natriumheparinrør). Til højere celletal kan leukocytkegler eller buffy coats anvendes. For at isolere PBMC’erne overføres blodet til et nyt 50 ml rør og fortyndes med sterilt 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i forholdet 1: 1 eller 1: 3 for henholdsvis frisk blod eller leukocytkegler / buffy coats. Bland forsigtigt cellerne flere gange ved inversion. Forbered 15 ml rør indeholdende 3 ml densitetsgradientmedium. Lag langsomt 8-10 ml fortyndet blod på toppen af densitetsgradientmediet, og centrifuger ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) uden bremse.BEMÆRK: Påfør blodet forsigtigt oven på densitetsgradientmediet for at forhindre blanding. Blanding kan resultere i tab af PBMC’er. Kassér forsigtigt det øverste lag (indeholdende plasmaet) med en Pasteur-pipette, saml det underliggende interfaselag, der indeholder PBMC’erne (hvid, ringlignende struktur), og overfør dette lag til et nyt 50 ml rør. Ophæng cellerne med steril 1x PBS op til 50 ml, og vask restdensitetsgradientmediet af ved centrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved RT med fuld bremse. For at fjerne resterende blodplader gentages processen med en ekstra langsommere centrifugering ved 200 x g i 10 minutter ved RT uden bremse. Valgfrit: For at fjerne overførslen af røde blodlegemer skal du fortynde røde blodlegemer lysebuffer (10x, materialefortegnelse) 1:10 i destilleret vand og påføre 3 ml af den fortyndede buffer på pelleten. Bland og inkuber i 3 min. Pellet vaskes i op til 50 ml 1x PBS, og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved RT med fuld bremse. Resuspender de isolerede og rensede PBMC’er i 20 ml 1x PBS og tæl dem ved hjælp af et hæmacytometer eller efter andre standardmetoder.BEMÆRK: Cellefortyndings- og celletællingsmetoderne skal justeres i overensstemmelse hermed baseret på den anvendte celletæthed og tælleanordning. 3. Berigelse af CD14+ monocytter fra PBMC’er Isoler CD14+ monocytter fra PBMC’erne med et humant CD14+ udvælgelsessæt i henhold til producentens protokol (materialetabel).BEMÆRK: Klassiske CD14 + CD16-monocytter er den vigtigste kilde til OC-prækursorer 35; Alternative rensningsmetoder kan overvejes. Overfør 1 x 107 PBMC’er til et passende polystyrenrør med rundbundet bund (dvs. der passer til selektionssætmagneten), og pellet cellerne ved 300 x g i 5 minutter. Supernatanten kasseres, cellepelletten resuspenderes i celleseparationsbuffer (PBS, 2 % føtalt bovint serum [FBS], 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA]) til en slutkoncentration på 1 x 108 celler/ml, og der inkuberes med 10 μL antistofcocktail pr. 100 μL med låg på i 10 minutter.BEMÆRK: Cellerne resuspenderes ved 1 x 108 celler / ml; Juster lydstyrkerne i overensstemmelse hermed. Efter inkubation tilsættes 10 μL af de magnetiske nanopartikelperler pr. 100 μL, og der inkuberes i 3 minutter med låg på.BEMÆRK: Juster volumenerne af antistofcocktailen og magnetperlerne for at opnå en koncentration på 10 μL / ml. Fyld volumen op til 2,5 ml med celleseparationsbufferen, anbring røret i en magnet (uden låg) og inkuber i 3 min. Kassér den negative cellepopulation ved en kontinuerlig bevægelse ved inversion, mens røret stadig er i magneten.BEMÆRK: Hvis du bruger >2 x 108 PBMC’er og en større magnet, skal du fylde op til 5 ml eller 10 ml med celleseparationsbuffer efter producentens anvisninger. Fjern røret fra magneten, og vask de berigede CD14+ monocytter, der er fastgjort til magnetperlerne, ved at resuspendere dem i 2,5 ml celleseparationsbuffer. Inkuber i 3 minutter inde i magneten som før, kassér den negative fraktion, og gentag endnu en gang. Alle de opsamlede celler centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 5 ml alfa-minimum essentielt medium (α-MEM). Tabel over materialer) suppleret med 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (komplet α-MEM) og 10% FBS.BEMÆRK: En renhedskontrol efter berigelse via flowcytometri anbefales, og ≥96% renhed bør forventes. Yderligere vasketrin (trin 3.6) kan øge renheden. 4. OC-differentiering in vitro Tæl de berigede CD14+ monocytter ved hjælp af et hæmacytometer. Ppellet cellerne ved 300 x g i 5 min, og resuspender ved 1 x 106 celler/ml i komplet α-MEM suppleret med 10% FBS. For at differentiere OC’erne tilsættes M-CSF i en slutkoncentration på 25 ng/ml til cellesuspensionen.BEMÆRK: For 1 ml cellesuspension tilsættes 0,25 μL M-CSF fra en stamkoncentration på 100 μg/ml. Bland ved pipettering grundigt for at homogenisere cellesuspensionen og plade 100 μL / brønd i en fladbundet 96-brøndplade til en endelig celledensitet på 1 x 105 celler / hul. Tilsæt 200 μL / brønd sterilt destilleret vand i hullerne omkring de belagte celler for at forhindre medium fordampning og kanteffekter i dyrkningssystemet. Cellerne inkuberes natten over i ca. 18-20 timer ved 37 °C med 5% CO2. Efter inkubation natten over fjernes forsigtigt halvdelen af substratet (50 μL/hul) ved aspiration ved hjælp af en P200-pipette, idet bunden af brønden undgås, og erstattes med frisk, varm komplet α-MEM indeholdende 10 % FBS, 25 ng/mL M-CSF og 50 ng/ml RANKL til en slutkoncentration på 25 ng/mlBEMÆRK: For 1 ml medium tilsættes 0,25 μL M-CSF og 0,5 μL RANKL fra en lagerkoncentration på 100 μg / ml. Skift mediet hver 3. dag, og differentier cellerne i OC’er i 7-14 dage (figur 1).BEMÆRK: Hold koncentrationerne M-CSF og RANKL konsistente i hele kulturen. Figur 1: OC-differentieringsarbejdsgang. Skematisk oversigt over CD14+ monocytisolering fra PBMC’er og differentiering i modne OC’er i nærvær af M-CSF og RANKL i 7-14 dage. RT = stuetemperatur. Billede oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur. 5. TRAP-farvning til osteoklaster Mediet fjernes forsigtigt, de differentierede vedhængende OC’er fastgøres med 100 μL/hul af den tidligere fremstillede fikseringsopløsning, og inkuberes i 1 min. Rør ikke ved bunden af brøndene for at undgå at ridse de klæbende celler.BEMÆRK: Den fikserende opløsning fremstilles som følger: 12,5 ml citratopløsning (inkluderet i TRAP-farvningssættet), 32,5 ml acetone og 5 ml 37% formaldehyd. Brøndene vaskes tre gange med 300 μL sterilt destilleret vand. Bank pladerne tørre efter vask. Forbered en farvningsopløsning i henhold til producentens anvisninger (materialetabel); tilsættes 5 μL Fast Granat og 5 μL natriumnitrit for at fremstille Fast Granet-opløsningen; blandes ved invertering og inkuberes i 3 minutter ved RT. Der fremstilles 1 ml farvningsopløsning ved at blande 900 μL sterilt destilleret vand, 10 μL naphthol, 40 μL acetatopløsning, 50 μL tartrat opløsning og 10 μL Fast Granat-opløsning. Der tilsættes 100 μL/hul frisklavet farvningsopløsning, og pladen inkuberes ved 37 °C i mørke i 20 minutter. Efter inkubation fjernes farvningsopløsningen ved invertering, og pladen vaskes tre gange med 300 μL/hul destilleret vand. Fjern overskydende vand ved at banke pladerne på køkkenrulle. Lad pladerne være åbne og beskyttet mod lys til lufttørring natten over.BEMÆRK: Tørre plader kan opbevares i op til 6 måneder. Nogle gange kan resterende buffere fremme udviklingen af skimmelsvamp, som er synlig under mikroskopet; Dette kan fjernes når som helst ved at vaske de berørte brønde med destilleret vand og lade dem lufttørre igen. Tag billeder ved 10x eller 20x ved hjælp af et brightfield-mikroskop med en fliseindstilling for at fange hele brøndoverfladen. Tæl manuelt OC’erne identificeret som TRAP + lilla farvede celler med mere end tre kerner ved hjælp af en billedanalysesoftware med et celletæller-plugin.BEMÆRK: Antallet af TRAP+ OC’er pr. brønd er donorafhængigt og kan variere fra ~200-1.600 OCs/well, med et gennemsnit på ca. 1.000 OCs/well. For at analysere dataene skal OC-numrene desuden bestemmes i tre forskellige brønde (tekniske replikater), og gennemsnittet skal beregnes for hver tilstand og for hver biologisk replikat. 6. Knogleresorptionsanalyse De friskberigede CD14+ monocytter anbringes på 96-brønds osteoanalyseplader belagt med calciumphosphat ved 1 x 105 celler/brønd, og OC’erne differentieres i 7-14 dage, som angivet i trin 4.1-4.8, og substratet skiftes hver 3. dag.BEMÆRK: Dentin/elfenben eller kvæg kortikale knogleskiver kan anvendes i stedet for osteo-assay plader. I så fald bør kulturens samlede tid forlænges til 14-21 dage på grund af det mere komplekse substrat, der skal resorberes. Ved sluttidspunktet skal du forsigtigt fjerne mediet, undgå at røre bunden af brønden og lyse cellerne med 10% natriumhypochloritopløsning. Vask brøndene tre gange med destilleret vand. Scan tørpladerne ved hjælp af et brightfieldmikroskop, og analysér/kvantificer de erhvervede billeder af resorptionsgruberne ved hjælp af en billedanalysesoftware. 7. Actinring fluorescerende farvning Plade 100 μL/brønd af de isolerede CD14+ monocytter i et 18-brønds kammerobjektglas ved en celletæthed på 1 x 105 celler/brønd. Differentier OC’erne i nærvær af M-CSF og RANKL som beskrevet før (trin 4.1-4.8), herunder skift af mediet hver 3. dag. Ved sluttidspunktet fjernes substratet forsigtigt, og hvert hul vaskes to gange med 200 μL/hul forvarmet PBS, pH 7,4. Lad ikke brøndene tørre mellem nogen af trinene. Prøven fastgøres med 100 μL/hul 4% formaldehydopløsning i PBS, og inkuberes i 10 minutter ved RT på en orbitalryster med forsigtig omrystning.BEMÆRK: Methanol kan forstyrre actin under fikseringsprocessen. Derfor er det bedst at undgå methanolholdige fikseringsmidler. Det foretrukne fikseringsmiddel er methanolfri formaldehyd. Den orbitalryster, der blev brugt i dette trin i protokollen, blev indstillet til en effektindstilling på 3 ud af 10. Vask to gange med 200 μL / hul PBS, permeabiliser cellerne med 100 μL / hul 0,1% Triton X-100 opløsning fortyndet i PBS og inkuber i 10 minutter ved RT på en orbital ryster med let omrystning. Der vaskes to gange med 200 μL/hul PBS. For at blokere ikke-specifik binding og øge signalet tilsættes 100 μL/hul blokerende opløsning fremstillet med 2% bovin serumalbumin (BSA)/PBS-opløsning. Inkuber i 20 minutter ved RT på en orbital shaker med let omrystning. Den blokerende opløsning fjernes, og der tilsættes 100 μL/hul fluorescerende konjugeret phalloidinopløsning fortyndet i 2 % BSA/PBS-opløsning. Inkuber i 20 minutter ved RT på en orbital shaker med blid omrystning og beskyttet mod lys.BEMÆRK: Juster koncentrationen af phalloidinfarvestoffet i henhold til producentens anbefalinger. Der vaskes to gange med 200 μL/hul PBS, pletteres kernerne med 100 μL/hul af en PBS-opløsning indeholdende 300 nM DAPI, og der inkuberes i 10-15 minutter ved RT på en orbitalryster med let omrystning og beskyttet mod lys.BEMÆRK: DAPI fortyndes i destilleret vand for at fremstille en 14,3 mM (5 mg / ml) DAPI-stamopløsning. Stamopløsningen fortyndes yderligere til den endelige koncentration på 300 μM. Endelig fortyndes 300 μM DAPI-opløsningen endnu en gang i PBS til en slutkoncentration på 300 nM. Efter 10-15 minutter fjernes DAPI-opløsningen, og den erstattes med 100 μL/brønd PBS.BEMÆRK: Afhængigt af de valgte kammerskinner skal du enten opbevare med et passende volumen PBS (100 μL/hul til 18-brønds kammerglider) eller montere objektglasset med dæksedler og et passende monteringsmedium. Kammerrutsjebanerne kan opbevares i op til 1 uge i køleskabet. Til 18-brønds kammerglas skal du bruge et 50-100 μL farvningsvolumen og 200-300 μL til vask. Skaler op for de andre kammerdiasstørrelser i overensstemmelse hermed. For at undgå fordampning skal dækslerne opbevares inde i en overdækket beholder under inkubationstiderne. Brug af en orbital shaker anbefales, men er ikke afgørende. Visualiser farvningen ved hjælp af passende immunofluorescens eller konfokale mikroskoper og forstørrelser mellem 4x og 40x. 8. Berigelse af modne OC’er og OC-forløbere via flowcytometrisortering De friskberigede CD14+ monocytter resuspenderes ved 1 x 106 celler/ml, og de differentieres til modne OC’er ved tilstedeværelse af M-CSF og RANKL på samme måde som beskrevet ovenfor (trin 4.1-4.8).BEMÆRK: Når du skalerer op fra en plade med 96 brønde til en større pladestørrelse, skal du følge tabel 1; Disse volumener beregnes ud fra en 1 x 106 celler / ml opløsning og giver en optimal densitet for celle-celle fusion. På dag 7 vaskes hullerne én gang med varm PBS, og der tilsættes 50 μL til 1 ml accutase (volumen bestemt af den anvendte pladestørrelse). Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 20 minutter. Efter inkubation skal du kontrollere pladerne under et lysmikroskop for at se, om cellerne har løsnet sig. Fjern desuden cellerne ved at banke pladerne på alle sider og pipettere dem op og ned. Opsaml cellesuspensionen i et 15 ml konisk rør. Hullerne vaskes med varm PBS (ingen Ca 2+, ingen Mg2+), og kombiner dem med cellesuspensionen. Gentag trin 8.2-8.3 en eller to gange, indtil de fleste celler har løsnet sig.BEMÆRK: Accutase, den anbefalede metode før overfladefarvning til flowcytometrisk analyse, løsner ikke meget store OC’er. Inddrivelsesgraden er ~ 50% -70%. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter, resuspender cellepelleten i 1 ml PBS, og tæl cellerne ved prøvepanblå udelukkelse. Resuspender cellerne ved 1 x 106 celler/ml, fjern 100 μL svarende til 1 x 105 celler, og overfør disse celler til et nyt reagensglas af polypropylen. Tilsæt 200 μL af cellesorteringsbufferen, og læg den til side på is som den ubejdsede kontrol. Plet resten af cellerne med levende/dødt farvestof fortyndet kl. 1:750 i 10 minutter ved RT og beskyttet mod lys.BEMÆRK: Levende / død farvning skal udføres i fravær af FBS for at undgå høj baggrundsfarvning. Fyld 15 ml opsamlingsrøret indeholdende den levende/døde farvede cellesuspension op med varm cellesorteringsbuffer (1x PBS, ingen Ca 2+, ingen Mg2+, 1% FBS og 5 mM EDTA), og centrifuger ved 300 x g i 5 minutter for at pelletere cellerne.BEMÆRK: En høj koncentration af EDTA og en lav koncentration af FBS anbefales i sorteringsbufferen for at forhindre celleklumper. Fjern et volumen svarende til 1 x 105 celler, og overfør dem til et nyt polypropylenreagensglas til OSCAR-isotypekontrollen. Overfør alle de resterende celler til et andet polypropylenreagensglas til farvning og cellesortering.BEMÆRK: Polypropylen reagensglas bruges til sortering, da cellerne er mindre tilbøjelige til at klæbe til disse rør end til polystyrenrør. Drej glassene ved 400 x g i 5 minutter for at pelletere cellerne, og kassér den overskydende supernatant ved invertering. Cellepelletsen resuspenderes i en antistofmasterblandingsopløsning fremstillet efter tabel 2. Plet OSCAR isotype kontrolrøret med CD14 antistof og OSCAR isotype kontrol i stedet for OSCAR antistoffet. Cellerne inkuberes ved 4 °C beskyttet mod lyset i 30 minutter. Efter 30 minutter vaskes cellerne ved at tilsætte fem volumener af cellesorteringsbufferen, og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender cellerne i 300-1.000 μL koldcellesorteringsbuffer, og erhverver cellerne ved hjælp af en flowcytometrisorteringsmaskine udstyret med en 100μM dyse.BEMÆRK: OC’er er meget klæbrige celler, så det er vigtigt at filtrere dem gennem en steril 70 μm membran inden sortering. Gate OC’erne og præ-OC’erne som CD14−OSCAR+. Indstil OSCAR+ -porten baseret på OSCAR-isotype-kontrolrøret. De sorterede celler samles i reagensglas af polypropylen, der indeholder komplet α-MEM suppleret med 20 % FBS ved 8 °C. Efter sortering pelleteres cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved RT, tæller cellerne og resuspenderes til downstream-applikationer.BEMÆRK: For at få ~ 1 x 105 sorterede præ-OC’er / OC’er skal du normalt starte fra ~ 10 x 106 celler belagt på dag 0. Den lave genoprettelseshastighed påvirkes af celletab under løsrivelse med accutase og af behandlingen til farvning og sortering. Det anbefales at udføre hele proceduren ved hjælp af sterile buffere og reagenser og arbejde under sterile forhold. 9. ATP-analyse for mitokondrieaktivitet De berigede CD14+ monocytter inkuberes i nærvær af M-CSF og RANKL i en 96-brønds plade på samme måde som beskrevet før (trin 4.1-4.8). Plade fire ekstra betingelser i tre eksemplarer til brug som kontrol. Udfør ATP-analysen med luminescens-ATP-detektionsanalysesættet i henhold til producentens manual. For at forberede ATP-opløsningen tilsættes kort 10 ml substratbufferopløsning til det frysetørrede substrat og lade det inkubere ved RT i 30 minutter.BEMÆRK: Forskellige metoder kan bruges til at måle den intracellulære ATP-produktion. Heri har vi brugt detektion af ATP-produktion ved luminescens. Under inkubationen fremstilles og tilsættes kontrollerne direkte til kontrolhullerne som følger: 2-Deoxy-D-glucose (2DG) ved 10 mM og 100 mM, oligomycin ved 1 μM og 100 mM 2DG i kombination med 1 μM oligomycin. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.BEMÆRK: 2DG blokerer glykolyse, mens oligomycin er en hæmmer af oxidativ phosphorylering. Kombination af disse to hæmmere resulterer i fuldstændigt tab af ATP-produktion via glykolyse og oxidativ phosphorylering, hvilket betyder, at de tjener som en intern kontrol for ATP-assayet. Til 10 mM og 100 mM 2DG-kontroller tilsættes henholdsvis 0,5 μL og 5 μL 2M 2DG stamopløsning pr. 100 μL kulturbrønd. For 1 μM oligomycin fortyndes 5 mM stamopløsningen 1:100 i medium, og der tilsættes 2 μL/hul til de dedikerede kontrolhuller. Til den sidste kontrol tilsættes 5 μL 2DG og 2 μL fortyndet oligomycinopløsning pr. hul. Der tilsættes 50 μL ATP-opløsning til hvert hul for at stoppe reaktionen, og inkuberes ved RT på en ryster ved 700 omdr./min. i 5-10 minutter beskyttet mod lys. 100 μL af supernatanten overføres til en hvidbundsplade med 96 huller, der er specifik for ATP-analysen, og pladen aflæses ved hjælp af en luminescenslæser.

Representative Results

OC-generering fra CD14+ monocytterDenne metode havde til formål let at skelne et stort antal OC’er fra humant perifert blod CD14+ monocytter in vitro, typisk i 1 uge. For det første blev CD14+ monocytter beriget fra PBMC’er og primet med M-CSF natten over for at opregulere RANK, som tidligere rapporteret15. Efter monocytpriming blev der anvendt RANKL-koncentrationer på 1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml sammen med 25ng/mL M-CSF for at bestemme den optimale koncentration af RANKL til OC-differentiering og modning. Tilføjelsen af RANKL producerede et stigende antal store TRAP-positive multinucleated OC’er på en dosisafhængig måde, og dette blev vurderet ved hjælp af TRAP-farvning. Modne OC’er defineres som TRAP-positive celler med flere kerner (typisk mere end tre; Figur 2A, B og supplerende figur 1). Desuden blev kinetikken af OC-differentiering fra monocytter undersøgt ved hjælp af TRAP-farvning og lysmikroskopi over en 2-14 dages dyrkningsperiode. I dette tilfælde blev OC-differentiering ved hjælp af en mellemkoncentration på 50 ng/ml RANKL valgt til at vurdere, hvor hurtigt OC’er differentierede sig i kultur. Under disse dyrkningsforhold var multinucleated OC’er synlige fra dag 5 og fremefter, og optimal differentiering blev nået på dag 7 (figur 2C). Den langvarige inkubation af kulturer ud over 10 dage på plast resulterede i unormalt store smeltede celler. I denne protokol bruges dag 6-8 normalt som det optimale endepunkt for OC-generering. OC’erne kan kvantificeres eller anvendes til downstream-assays. Funktionel vurdering af differentierede OC’erFor at bestemme den funktionelle aktivitet af de genererede OC’er undersøgte vi deres resorptive aktivitet ved at differentiere OC’erne på en mineraliseret overflade. Da store OC’er kun genereres efter en 7-dages dyrkningsperiode og for at give tilstrækkelig tid til at resorbere mineralsubstratet, blev kulturerne opretholdt indtil dag 10. Dannelsen af runde huller eller resorptionsgruber blev kun observeret på de mineraliserede overflader af brønde indeholdende celler, der var blevet behandlet med både M-CSF og RANKL (figur 3). Således tillader procentdelen af opløst mineraliseret overflade (resorptionsgruber) bestemmelse af OC-resorptionskapaciteten. Derudover viste OC’erne, der differentierede sig efter denne protokol frem til dag 7, både på plast- og glaskammerdias, en velorganiseret aktinringstruktur, der kunne visualiseres ved immunofluorescerende farvning (supplerende figur 2). Effekt af en hæmmer på moden OC-funktionDe ovennævnte dyrkningsbetingelser blev anvendt til at bestemme den funktionelle evne af de in vitro genererede OC’er i nærvær af den kendte OC-hæmmer, rotenon34. OC’erne blev differentieret i 6-8 dage, og CD14-OSCAR + OC’er og OC-forstadier blev beriget via flowcytometri (figur 4). De berigede celler blev derefter belagt med 50.000 celler / pr. Brønd på en mineralbelagt 96-brøndplade i pro-osteoklastogent medium (25 ng / mL, M-CSF og RANKL) i 3 dage. Behandling med rotenon (figur 5A,B) hæmmede dosisafhængig resorptionen af den mineraliserede overflade sammenlignet med den ubehandlede kontrolbrønd, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser34. Derudover blev OC-funktionalitet vurderet via ATP-produktion og aktinringdannelse. Den rotenonafhængige hæmning af OC-resorption var forbundet med hæmningen af ATP-produktionen (figur 5C). Resorberende OC’er er stærkt polariserede celler, der regulerer deres resorptive kapacitet ved at fremme cytoskeletal organisation. Alexa fluor 647 konjugeret phalloidin blev brugt til at mærke F-actin cytoskelettet af de modne OC’er dyrket i nærvær eller fravær af rotenon. Rotenon forårsagede fragmenteringen af den RANKL-afledte actinring af de modne OC’er (figur 5D). Figur 2: OC’er, der effektivt adskiller sig fra CD14+ monocytprækursorer. CD14+ monocytter blev magnetisk beriget, belagt med 1 x 105 celler/brønd i 96-brønds plader og inkuberet natten over med 25 ng/mL M-CSF. (A) M-CSF-primede monocytter blev stimuleret med stigende koncentrationer af RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml), fikseret og farvet til TRAP på dag 7. Billeder blev erhvervet, og TRAP + multinucleated celler (MNC’er) blev talt. Repræsentative billeder af TRAP-farvning er vist i supplerende figur 1. Fejlbjælkerne viser middelværdien ± SD (n = 3). Dataene blev analyseret med en envejs ANOVA og Holm-Sidaks multiple sammenligningstest for parrede data; * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,005. (B) Repræsentativt billede af en TRAP-farvet brønd med en 96-brønds plade, der viser den typiske mængde OC’er/forventet brønd og deres morfologi under 25 ng/ml RANK-L sammenlignet med M-CSF-afledte makrofager på dag 7. Skalastænger: 1000 μm. (C) Repræsentative billeder af OC-dannelse under 50 ng/ml RANKL vurderet via TRAP-farvning fra dag 2 til dag 14. OC’er er synlige fra dag 5 og fremefter. Kæmpe unormalt smeltede OC’er er til stede efter 10 dage. Skalastænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Resorptive OC’er differentieret fra CD14+ monocytter. CD14+ celler isoleret fra PBMC’er blev differentieret i 10 dage til OC’er i nærvær af 25 ng/mL M-CSF (M) og RANKL (R) på mineralassayoverflade (osteo-assay) plader. (A) Billeder af repræsentative rekonstruerede brønde taget ved 10x forstørrelse for at analysere resorptionen på dag 10 (mineralsubstrat i gråt; resorptionsgruber i hvidt). Skalastænger: 1000 μm. (B) Kvantificering af procentdelen af det resorberede areal. Resorptionsdataene blev analyseret med en Wilcoxon-parret analyse. Fejlbjælkerne viser middelværdien ± SD (n = 7). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Flowcytometriberigelse af CD14-OSCAR + OC’er. CD14+ monocytter blev beriget fra PBMC’er, og OC’erne blev differentieret som tidligere beskrevet. Adhærente OC-kulturer blev løsrevet med accutase og farvet til flowcytometri. (A-C) OC’er på dag 8 blev sorteret baseret på CD14 og OSCAR-udtryk. (A) Repræsentativ sorteringsstrategi. Cellerne blev lukket som singlets, negative for død farvning, og CD14 + OSCAR + (rød) og CD14 – OSCAR + (blå) undergrupper blev sorteret. B) Repræsentative plots, der viser den overlappende OSCAR-farvning af RANKL-afledte OC’er (cyan) og kontrolmakrofager afledt af M-CSF (orange). I rødt er OSCAR isotype-farvet kontrol af RANKL-afledte OC’er. (C) De sorterede populationer blev belagt med plast og fik lov til at klæbe i 2 timer i pro-OC-medium (25 ng/mL M-CSF og 50 ng/ml RANKL), efterfulgt af TRAP-farvning og visualisering. De repræsentative billeder viser mangel på TRAP+-celler i CD14+-delmængden (rød) og mono- og multinucleated TRAP+-præ-OC’er og OC’er i CD14-delmængden (blå). Skalastænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Assays til vurdering af funktionen af modne OC’er. For at evaluere funktionen af modne OC’er blev CD14+ celler isoleret fra PBMC’er dyrket enten med M-CSF (M) alene eller kombineret med RANKL (R) i 7 dage, OC’erne blev beriget via flowcytometri, og OC’erne blev derefter behandlet med inhibitoren rotenon i 24 timer. (A) Modne OC’er blev sorteret via flowcytometri (CD14-OSCAR +) og blev dyrket på en mineralsk analyseoverflade i nærvær eller fravær af rotenon i 3 dage, hvorefter cellerne blev bleget og afbildet ved 10x for at afsløre det resorberede område (resorptionsgruber i hvidt). (A) Repræsentative rekonstruerede billeder af brønde. Skalastænger: 1000 μm. (B) Kvantificering af procentdelen af det resorberede areal. Dataene i (B) blev analyseret med en envejs ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest (n = 7); * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,01. Fejlbjælkerne viser den gennemsnitlige ± SD. (C) Samlet intracellulært ATP-indhold af udifferentierede og dag 7 differentierede modne OC’er differentieret med RANKL og behandlet med enten vehikel eller rotenon (10 nM og 30 nM). Her blev 2DG og oligomycin anvendt som positive kontroller til analysen og blev tilsat 30 minutter før cellelyse og ATP-kvantificering. Fejlbjælkerne viser middelværdien ± SD (n = 4). Dataene blev analyseret med en envejs ANOVA og Dunnetts multiple sammenligningstest for parrede data. ** P ≤ 0,01. (D) Et repræsentativt 20x billede af modne OC’er farvet til actinringdannelse (rød) og kerner (blå), der viser tabet af actinringen med inhibitoren. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Plade format 96 brøndplade 48 brøndplade 24 brøndplade 12 brøndplade 6 brøndplade lydstyrke 100 μL 225-250 μL 450-500 μL 0,8-1 ml 1,8-2 ml Tabel 1: Volumen af cellesuspension for forskellige pladeformater. Volumenerne beregnes ud fra en 1 x 106 celler / ml opløsning og giver en optimal densitet for celle-celle fusion. Fluorofor, klon Volumen (μL) pr. 106 celler CD14 PE/cyanin7, HCD14 5 μL OSCAR FITC, REA494 10 μL Buffer til cellesortering 80 μL Tabel 2: Antistof master mix opløsning. Supplerende figur 1: TRAP-farvning af RANKL-dosisresponsen. CD14+ monocytter blev magnetisk beriget, belagt med 1 x 105 celler/brønd i 96-brøndsplader og inkuberet natten over med 25 ng/mL M-CSF, som i figur 2. Repræsentative billeder af TRAP-farvning viser MCSF-primede monocytter stimuleret med stigende koncentrationer af RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml og 100 ng / ml), fastgjort og farvet til TRAP på dag 7. Skalabjælker: 400 μm. Klik her for at downloade denne fil. Supplerende figur 2: Virkende ringfarvning i fuldt differentierede OC’er. (A) En 10x forstørrelse af OC’er differentieret på TC-plast og farvet med AF647 phalloidin (i rødt). Skalabjælke: 400 μm. (B) En 40x forstørrelse af OC’er differentieret på glaskammerglas og farvet med AF488 phalloidin (i gul). Skalabjælke: 100 μm.Kernerne farves med DAPI, vist med blåt i (A) og i cyan i (B). Klik her for at downloade denne fil. Supplerende figur 3: Forskellige FBS-batchers indvirkning på OC-differentieringseffektiviteten. OC’er blev differentieret fra CD14+ monocytter i nærvær af 25 ng/mL M-CSF og 50 ng/mL RANKL (MR) i 7 dage. Kontrolbrøndene havde kun M-CSF (M). (A) Repræsentative 10x forstørrelser (skalastænger: 400 μm) og (B) kvantificering af TRAP-farvede OC’er differentieret fra en donor i to forskellige batcher af FBS. Fejlbjælkerne viser den gennemsnitlige SD ± tre tekniske replikater. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den lette dyrkning og isolering af et stort antal funktionelle OC’er in vitro er vigtig for at fremme forståelsen af knoglebiologi og OC-medierede sygdomme. Klassisk blev OC’er genereret i co-kulturer med osteoblaster eller stromale celler og hæmatopoietiske celler fra milten eller knoglemarven^38,39. Et signifikant gennembrud i forståelsen af osteoklastogenese var identifikationen af RANKL som den vigtigste regulator af OC-dannelse, differentiering og overlevelse⁴⁰. Tidlige protokoller af RANKL-afhængige kultursystemer brugte PBMC’er til OC-generation^21,41,42. Disse blandede kulturer er imidlertid langvarige og præsenterer mange forvirrende faktorer, der begrænser evnen til at teste de direkte virkninger på OC-differentiering og funktion. Denne protokol beskriver en effektiv og pålidelig in vitro-model af osteoklastogenese fra humane perifere CD14⁺ monocytter, hvor optimal osteoklastonogenese kan opnås inden for 7 dage (figur 1 og figur 2), hvilket er betydeligt hurtigere sammenlignet med nogle andre protokoller^43,44,45,46. De vigtigste kendetegn ved denne protokol er (1) brugen af oprensede CD14⁺ monocytter, (2) priming af monocytterne med M-CSF før eksponering for RANKL, (3) kulturens længde (<7 dage) og (4) pålidelig påvisning af hæmning af OC-dannelse (TRAP-farvning) og funktion (resorption, ATP-produktion, reorganisering af aktinring) med inhibitorer.

Under optimeringen af metoden blev der identificeret flere kritiske punkter. Det er blevet observeret, at in vitro-differentieringen af OC’er i høj grad afhænger af såtætheden af CD14⁺ monocytterne. I denne protokol podes cellerne således med en høj densitet (1 x 10⁵ celler / brønd af en 96-brøndplade i 100 μL medium), da det er vigtigt for cellerne at kunne interagere med hinanden og være i nærheden af at smelte sammen og blive modne OC’er. På samme måde begrænser såning af celler med en tæthed, der er for høj, deres differentiering og vækst på grund af mediebegrænsninger og mangel på den krævede plads. For at opnå maksimal succes med denne protokol er det desuden vigtigt at udføre densitetsgradientadskillelsen omhyggeligt og sikre, at den berigede population af CD14⁺ celler er så ren som muligt. For eksempel resulterer utilstrækkelige vasketrin i manglende fjernelse af blodplader, hvilket følgelig hæmmer OC-differentiering^47,48. Tilsvarende kan tilstedeværelsen af mindre T-cellekontaminering i isolerede CD14⁺ præparater stimuleret med M-CSF alene resultere i OC-differentiering, potentielt via RANKL-sekretion af T-celler⁴⁹. Derfor er det vigtigt at inkludere en M-CSF-kontrol for hvert eksperiment. En rutinemæssig renhedskontrol, især når du bruger et nyt isolationssæt, anbefales også for at sikre prøvens renhed.

Optimale OC-tal (interval: ~ 200-1.600 OC’er / brønd) opnås ved hjælp af α-MEM-medium beriget med nukleosider og L-glutamin. Andre konventionelle kulturmedier, herunder Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påvirker OC-udbyttet. Kilden til FBS kan også påvirke osteoklastogenese. Forskellige batcher af FBS kan føre til reduceret RANK-L-afledt osteoklastogenese samt forekomsten af et lavt antal TRAP⁺ multinucleated celler i M-CSF-kontrollerne (supplerende figur 3). For at opnå konsistente resultater anbefales det derfor at teste nye FBS-batcher før brug og fortsætte med den samme batch gennem hele forsøgene for at minimere variationer i differentieringsprocessen. Derudover udgør donor-til-donor-variabilitet med hensyn til det samlede antal differentierede OC’er, der er opnået på sluttidspunktet, en begrænsning, når denne protokol bruges til at sammenligne f.eks. raske donorer med patienter. I disse tilfælde er det bydende nødvendigt at bruge nøjagtigt de samme betingelser og det samme parti medium, FBS og andre reagenser.

Et andet nødvendigt skridt for optimal OC-differentiering og modning er priming af monocytterne med M-CSF før RANKL-tilsætningen. Eksponeringen af cellerne for M-CSF 18-24 timer før RANKL primer monocytterne for at opregulere RANK-ekspression^15,26. Tilføjelsen af RANKL på dette tidspunkt sikrer optimal OC-differentiering på en dosisafhængig måde. Graden af OC-differentiering varierer fra donor til donor; 25 ng/ml RANKL er dog normalt tilstrækkeligt til at differentiere et stort antal OC’er hos de fleste donorer. Derudover kan 25 ng / ml RANKL anvendes i assays til indledende screening af forbindelser, da det letter evalueringen af både de forstærkende og hæmmende virkninger af testforbindelserne. Andre dyrkningssystemer har brugt længere M-CSF præinkubationstider før RANKL-tilsætning, men dette resulterer i en længere dyrkningstid for osteoklastogenese⁵⁰. Derudover forlader de primede monocytter at inkubere natten over, at de fastgøres til pladen, omend ikke i en fuldt klæbende tilstand. Derfor, når RANKL introduceres for første gang, skal mediet ændres halvt meget omhyggeligt snarere end fuldstændigt ændret for at forhindre løsrivelse og tab af de primede monocytter. Mediet skal også opdateres hver 3-4 dage for at undgå medium udtømning og forhindre celledød. På grund af det lave volumen, der anvendes i dette assay (100 μL/brønd i en 96-brøndsplade), er det desuden yderst vigtigt at have en ramme af tomme brønde, der er fyldt med en vandig opløsning (dvs. sterilt destilleret H₂O eller PBS) omkring analysehullerne. Dette forhindrer medium fordampning og kanteffekter.

Endelig er det for metaboliske assays (f.eks. ATP-assays) afgørende, at cellerne er levedygtige for at undgå enorm standardafvigelse mellem replikater (figur 5). Cellernes høje levedygtighed er også vigtig for sortering af cellerne og for den videre dyrkning af de sorterede OC’er (figur 4). Denne metode har dog flere begrænsninger. Fuldt modne OC’er er meget klæbende og vanskelige at løsne fra pladerne. De større OC’er er ofte umulige at løsne, hvilket kan føre til et lavere celleudbytte. Derfor skal cellerne tælles efter sortering og før plettering ved den krævede koncentration. Desuden anvendes i denne protokol en ikke-enzymatisk metode (accutase) til at løsne OC’erne for at forhindre membranændringer i nedstrøms overfladefarvning til flowcytometri. Brugen af celleskrabere (begge med bløde eller hårde ender) blev også testet og førte til høj celledød. Enzymatisk løsrivelse ved hjælp af 0,05% Trypsin / EDTA-opløsninger kan anvendes til et højere udbytte af løsrevne OC’er, når membranintegritet ikke er påkrævet til downstream-applikationer. For at forhindre, at OC’erne klumper sammen, anbefales det desuden stærkt at anvende en høj koncentration af EDTA i alle buffere efter celleløsrivelse samt passende filtrering inden flowcytometriopkøb. Det er vigtigt at bemærke, at OC-kulturer er en heterogen population af celler, der består af modne OC’er, OC-forløbere og makrofager. Makrofager kan let skelnes fra OC’er, selvom både mononukleare præ-OC’er og multinukleare OC’er udtrykker OSCAR og ikke kan skelnes med den nuværende metode (figur 4). Faktisk udgør sidstnævnte spørgsmål den største begrænsning af denne metode. Derudover er et lavt udtryk for OSCAR også til stede i M-CSF-kulturer (figur 4B) og kan indikere makrofager, der er primet til OC-afstamningsforpligtelse. Det er vigtigt at indstille porten til OSCAR⁺ -celler baseret på FMO-farvningssignalet, som vist i figur 4B.

Sammenfattende beskriver denne protokol en optimeret og robust metode til effektiv produktion af aktive og funktionelt modne OC’er fra cirkulerende primære humane monocytter. Styrken ved denne protokol er dens evne til at generere OC’er på kort tid og give et stort antal differentierede OC’er. Denne metode åbner vejen for at undersøge de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for OC-differentiering og funktion.

Materials

µ-Slide 18 well chamber slides	ibidi	81816
8-well glass chamber slides	Ibidi	80807
96-well TC plate	Corning	3596
96-well osteo assay stripwell plate	Corning	3989
Acetate solution	Sigma Aldrich	386-3	from kit Cat No. 387A-1KT
Acetone	VWR	20066.330
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit	SIGMA-ALDRICH	387A-1KT
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Theremo Fisher – Invitrogen	A12379	AF488
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher – Invitrogen	A22287	AF647
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose	Fisher Scientific	11321867	2DG, 98%
Alpha minimum essential medium	gibco	22571-020
ATPlite 1step	PerkinElmer	6016731	Luminiscence ATP detection assay system
BD FACSAria III cell sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom	Greiner bio-one	655083	White-bottom plates
Citrate solution	Sigma Aldrich	91-5	from kit Cat No. 387A-1KT
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes	Fisher Scientific	352054
Corning osteo assay surface multiple well plate	Sigma-Aldrich	CLS3989
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell	Corning	CLS3989-2EA
DAPI	Theremo Fisher	D3571
EasySep human CD14 positive selection kit	STEMCELL Technologies	17858
EasySep red blood cell lysis buffer (10x)	StemCell Technologies	20110
eBioscience fixable viability dye eFluor 780	Theremo Fisher – Invitrogen	65-0865-14
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E7889-100ML
EVOS FL auto imaging system	Thermo Fisher	A32678
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap	Fisher Scientific	10314791
Falcon tubes 15 mL	Corning	430790
Falcon tubes 50 mL	Corning	430828
Fast Garnet GBC base solution	Sigma Aldrich	387-2	from kit Cat No. 387A-1KT
Fetal bovine serum	gibco	10500-064	FBS
Ficoll-Paque Plus	cytiva	17144003
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F-8775
Human sRANK ligand	PEPROTECH	310-01-100UG	Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)
ImageJ Image analysis software	Image J	version 2.9.0
L-glutamine	gibco	25030-024
Lithium heparin tubes (9 mL)	VACUETTE	455084
Macrophage colony-stimulating factor	PEPROTECH	300-25-100UG	M-CSF
Napthol AS-BI phosphoric acid solution	Sigma Aldrich	387-1	from kit Cat No. 387A-1KT
Neubauer hemacytometer counting chamber	Camlab	SKU 1127885
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes	Sigma-Aldrich	Q4876-5MG
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit	Miltenyi Biotec	130-107-661 and 130-107-617	Clone REA494
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody	Biolegend	325618	Clone HCD14
Penicilin/streptomycin	SIGMA	P0781
PHERAstar machine and software	BMG LABTECH
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)	gibco	14190-094
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-443
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044-1L
Sodium nitrite solution	Sigma Aldrich	91-4	from kit Cat No. 387A-1KT
Tartrate solution	Sigma Aldrich	387-3	from kit Cat No. 387A-1KT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154-100ML