Osteoklaster er viktige beinresorberende celler i kroppen. Denne protokollen beskriver en pålitelig metode for in vitro differensiering av osteoklaster fra humane perifere blodmonocytter. Denne metoden kan brukes som et viktig verktøy for å forstå osteoklastbiologi i homeostase og i sykdommer.
Osteoklaster (OC) er beinresorberende celler som spiller en sentral rolle i skjelettutvikling og remodellering av voksne bein. Flere beinforstyrrelser er forårsaket av økt differensiering og aktivering av OC, så inhiberingen av denne patobiologien er et sentralt terapeutisk prinsipp. To nøkkelfaktorer driver differensieringen av OC fra myeloide forløpere: makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor kappa-B-ligand (RANKL). Humane sirkulerende CD14+ -monocytter har lenge vært kjent for å differensiere til p-piller in vitro. Eksponeringstiden og konsentrasjonen av RANKL påvirker imidlertid differensieringseffektiviteten. Faktisk har protokoller for generering av humane OCs in vitro blitt beskrevet, men de resulterer ofte i en dårlig og langvarig differensieringsprosess. Her er det gitt en robust og standardisert protokoll for å generere funksjonelt aktive modne humane OC-er i tide. CD14+ monocytter er beriket fra humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og primet med M-CSF for å oppregulere RANK. Påfølgende eksponering for RANKL genererer p-piller på en dose- og tidsavhengig måte. P-piller identifiseres og kvantifiseres ved farging med syreresistent tartratfosfatase (TRAP) og lysmikroskopianalyse. Immunfluorescensfarging av kjerner og F-aktin brukes til å identifisere funksjonelt aktive OC. I tillegg anrikes OSCAR+CD14− modne p-piller ytterligere via flowcytometricellesortering og OC-funksjonalitet kvantifisert ved mineralske (eller dentin/bein) resorpsjonsanalyser og aktinringdannelse. Endelig brukes en kjent OC-hemmer, rotenon, på modne OC, noe som viser at adenosintrifosfat (ATP) produksjon er avgjørende for aktinringintegritet og OC-funksjon. Avslutningsvis etableres en robust analyse for å differensiere høyt antall OCer i dette arbeidet, som i kombinasjon med aktinringfarging og en ATP-analyse gir en nyttig in vitro-modell for å evaluere OC-funksjonen og å skjerme for nye terapeutiske forbindelser som kan modulere differensieringsprosessen.
Osteoklaster (OC) er multinukleerte gigantiske celler av hematopoietisk avstamning med en unik evne til å resorbere bein. De er ansvarlige for utvikling og kontinuerlig ombygging av skjelettet 1,2. I skjelettfasene av utvikling er OCs og vevsbosatte makrofager avledet fra erytro-myeloide progenitorer og koloniserer beinnisjen og organvevet. Under fysiologiske forhold kreves erytro-myeloide progenitorer for normal beinutvikling og tannutbrudd, mens tilstrømningen av sirkulerende blodmonocytter inn i beinnisjen gir postnatalt vedlikehold av OCs, benmasse og benmarghule3. Under patologiske forhold rekrutteres monocytter til steder med aktiv betennelse og kan bidra til patologisk bein ødeleggelse 4,5.
Pasienter med flere former for leddgikt opplever leddbetennelse, noe som fører til progressiv felles ødeleggelse forårsaket av OCs6. For eksempel, i revmatoid artritt (RA), er overaktiverte OCs ansvarlige for patologisk beinerosjon og felles ødeleggelse 7,8, og nåværende behandlinger forbedrer eller stopper ofte ikke beinskader9,10,11. Endringer i sirkulerende monocytter både med hensyn til populasjonsfordeling og transkriptomiske og epigenetiske signaturer er rapportert hos RA-pasienter12,13,14. Videre er det rapportert at endret monocytrespons på inflammatorisk stimulering påvirker osteoklastogenese hos RA-pasienter med aktiv sykdom15,16,17.
Differensieringen av p-piller er en kompleks flertrinnsprosess som omfatter myeloide forløpercellers forpliktelse til differensiering i OC-forløpere. Under osteoklastogenese blir p-piller gigantiske og multinukleerte gjennom cellefusjon, ufullstendig cytokinese og en kjernefysisk resirkuleringsprosess beskrevet som fisjon og fusjon18,19,20. Evnen til å differensiere p-piller in vitro har muliggjort betydelige fremskritt i forståelsen av beinbiologi21. OC-er skiller seg fra forløpere ved eksponering for makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor kappa-B-ligand (RANKL). Sistnevnte er avgjørende for normal utvikling og funksjon av p-piller in vitro og in vivo, selv under inflammatoriske tilstander 6,22,23. RANKL presenteres av osteoblaster og osteocytter, samt av aktiverte T-celler og fibroblaster i betent RA-synovium 2,24,25. Under OC-differensieringsprosessen oppregulerer monocytter eksponert for M-CSF reseptoraktivatoren av nukleær faktor kappa-B (RANK) uttrykk på cellemembranen og, under etterfølgende stimulering med RANKL, differensierer til tartratresistent syrefosfatase (TRAP)-positive mononukleære pre-OCs og deretter til multinukleerte OCs15,26. OC-er produserer flere enzymer, den viktigste blant dem er TRAP, som muliggjør nedbrytning av fosfoproteiner i bein27. En regulator og markør for OC-differensiering er den OC-assosierte reseptoren (OSCAR). Det oppreguleres tidlig i forløperceller som forplikter seg til OC-linjen28. Modne gigantiske multinukleerte OC-er kan nedbryte (resorbere) skjelettmatrisen ved å generere en stor tetningssone, som er laget av en aktinring som omgir en ruffled grense21,29,30. Benresorpsjonsevnen til OC-er krever cytoskjelettomorganisering og den påfølgende polariseringen og dannelsen av en kronglete membran, som er den såkalte ruffled grensen. Den ruffled grensen er omgitt av et stort sirkulært bånd av en F-aktinrik struktur, som er aktinringen eller tetningssonen. Aktinringintegritet er avgjørende for at p-piller skal resorbere ben både in vitro og in vivo, og defekt ruffled border formation er assosiert med lavere vakuolær adenosintrifosfatase (V-ATPase) uttrykk31,32,33. Videre er p-piller mitokondrierrike celler, og adenosintrifosfat (ATP) assosierer med mitokondrielignende strukturer i OC-er lokalisert ved den rufsete grensen31,32,33. Rotenon virker som en sterk hemmer av mitokondriekomplekset I og påvirker ATP-produksjonen. Rotenon har også vist seg å hemme OC differensiering og funksjon34.
Denne protokollen beskriver en effektiv og optimalisert metode for in vitro osteoklastogenese fra humane perifere blodprøver. I humant perifert blod er CD14+-monocytter hovedkilden til p-piller15,35,36. I denne protokollen er kinetikken for eksponering og konsentrasjonen av M-CSF og RANKL justert for optimal osteoklastogenese. Mononukleære celler separeres først fra erytrocytene og granulocytter som er tilstede i fullblod ved tetthetsgradient; de blir deretter beriket for CD14+ monocytter ved hjelp av positivt utvalg av magnetiske perler. De isolerte CD14+-monocyttene inkuberes deretter over natten med M-CSF. Dette primer monocyttene for å oppregulere uttrykket av RANK15,26. Den påfølgende tilsetningen av RANKL induserer osteoklastogenese og multinukleasjon på en tidsavhengig måte. Aktivresorberende p-piller viser den karakteristiske fordelingen av F-aktinringer ved kanten av cellemembranen30,32 og farging for TRAP. Modne OC-er analyseres ved å kvantifisere TRAP+ multinukleerte (mer enn tre kjerner) celler. Den funksjonelle kapasiteten til modne poc-er kan vurderes ved resorpsjon, aktinringintegritet og ATP-produksjon. Videre kan differensierte CD14− OSCAR+ OC-er berikes og brukes til å vurdere effekten av visse forbindelser på OC-funksjonalitet via mineralresorpsjon (eller dentin) og F-aktinorganisasjon. I tillegg, i dette arbeidet, brukes en kjent OC-hemmer, rotenon, som et eksempel på en forbindelse som påvirker funksjonaliteten til OC. Redusert OC-resorpsjonsaktivitet under rotenon er assosiert med redusert ATP-produksjon og aktinringfragmentering. Avslutningsvis etablerer denne protokollen en robust analyse som kan brukes som referansemetode for å studere flere biologiske aspekter ved OC-differensiering og funksjon in vitro.
Denne metoden kan brukes til å vurdere (1) potensialet for sirkulerende monocytter for å differensiere til OCs i helse og sykdommer, samt (2) virkningen av terapeutiske kandidater på OC differensiering og funksjon. Denne robuste osteoklastogeneseprotokollen gjør det mulig å bestemme effekten og mekanismene til beinmålrettede terapier på både OC-differensiering fra forløperceller og funksjonen til modne OCer.
Den enkle dyrkingen og isoleringen av et stort antall funksjonelle p-piller in vitro er viktig for å fremme forståelsen av beinbiologi og OC-medierte sykdommer. Klassisk ble p-piller generert i kokulturer med osteoblaster eller stromale celler og hematopoietiske celler fra milten eller benmargen38,39. Et signifikant gjennombrudd i forståelsen av osteoklastogenese var identifiseringen av RANKL som den viktigste regulatoren for OC-dannelse, differensiering og overlevelse40. Tidlige protokoller av RANKL-avhengige kultursystemer benyttet PBMC for OC generasjon21,41,42. Imidlertid er disse blandede kulturene lange og presenterer mange forstyrrende faktorer som begrenser evnen til å teste de direkte effektene på OC differensiering og funksjon. Denne protokollen beskriver en effektiv og pålitelig in vitro-modell for osteoklastogenese fra humane perifere CD14+-monocytter der optimal osteoklastogenese kan oppnås innen 7 dager (figur 1 og figur 2), noe som er betydelig raskere sammenlignet med noen andre protokoller43,44,45,46. De viktigste kjennetegnene ved denne protokollen er (1) bruk av rensede CD14+-monocytter, (2) priming av monocyttene med M-CSF før eksponering for RANKL, (3) lengden på kulturen (<7 dager) og (4) pålitelig påvisning av hemming av OC-dannelse (TRAP-farging) og funksjon (resorpsjon, ATP-produksjon, aktinringreorganisering) med inhibitorer.
Under optimaliseringen av metodikken ble flere kritiske punkter identifisert. Det har blitt observert at in vitro-differensieringen av p-piller i stor grad er avhengig av såtettheten til CD14+-monocyttene. I denne protokollen blir cellene sådd med høy tetthet (1 x 105 celler / brønn av en 96-brønnsplate, i 100 μL medium), da det er viktig for cellene å kunne samhandle med hverandre og være i nærheten av å smelte sammen og bli modne OC. På samme måte begrenser såceller med en tetthet som er for høy deres differensiering og vekst på grunn av middels begrensninger og mangel på nødvendig plass. Videre, for å oppnå maksimal suksess med denne protokollen, er det viktig å utføre tetthetsgradientseparasjonen nøye og for å sikre at den berikede populasjonen av CD14 + -celler er så ren som mulig. For eksempel resulterer utilstrekkelige vasketrinn i mangel på fjerning av blodplater, noe som følgelig hemmer OC-differensiering47,48. På samme måte kan tilstedeværelsen av mindre T-cellekontaminering i isolerte CD14+-preparater stimulert med M-CSF alene resultere i OC-differensiering, potensielt via RANKL-sekresjon av T-celler49. Derfor er det viktig å inkludere en M-CSF-kontroll for hvert eksperiment. En rutinemessig renhetskontroll, spesielt ved bruk av et nytt isolasjonssett, anbefales også for å sikre prøvens renhet.
Optimale OC-tall (område: ~ 200-1,600 OC / brønn) oppnås ved bruk av α-MEM-medium beriket med nukleosider og L-glutamin. Andre konvensjonelle kulturmedier, inkludert Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påvirker OC-utbyttet. Kilden til FBS kan også påvirke osteoklastogenese. Ulike partier av FBS kan føre til redusert RANK-L-derivert osteoklastogenese, samt utseendet på lavt antall TRAP + multinukleerte celler i M-CSF-kontrollene (tilleggsfigur 3). Derfor, for å oppnå konsistente resultater, anbefales det å teste nye FBS-batcher før bruk og fortsette med samme batch gjennom forsøkene for å minimere variasjoner i differensieringsprosessen. I tillegg utgjør variasjon fra donor til donor, i form av totalt antall differensierte p-piller oppnådd ved slutttidspunktet, en begrensning når man bruker denne protokollen til å sammenligne for eksempel friske donorer med pasienter. I disse tilfellene er det viktig å bruke nøyaktig de samme forholdene og samme masse medium, FBS og andre reagenser.
Et annet nødvendig skritt for optimal OC-differensiering og modning er priming av monocyttene med M-CSF før RANKL-tillegget. Eksponeringen av cellene til M-CSF 18-24 timer før RANKL primer monocyttene for å oppregulere RANK-uttrykk15,26. Tillegg av RANKL på dette tidspunktet sikrer optimal OC-differensiering på en doseavhengig måte. Graden av OC-differensiering varierer fra donor til donor; Imidlertid er 25 ng / ml RANKL vanligvis tilstrekkelig til å skille et høyt antall OCs i de fleste givere. I tillegg kan 25 ng / ml RANKL brukes i analyser for den første screeningen av forbindelser, da det letter evalueringen av både de forbedrende og hemmende effektene av testforbindelsene. Andre dyrkningssystemer har brukt lengre M-CSF preinkubasjonstid før RANKL-tillegg, men dette resulterer i lengre dyrkingstid for osteoklastogenese50. I tillegg forlater de primede monocyttene å inkubere over natten, slik at de kan feste seg til platen, om enn ikke i en fullt adherent tilstand. Derfor, når RANKL introduseres for første gang, må mediet halvskiftes veldig forsiktig i stedet for helt endret for å forhindre løsrivelse og tap av de primede monocyttene. Mediet må også oppdateres hver 3-4 dager for å unngå middels uttømming og forhindre celledød. Videre, på grunn av det lave volumet som brukes i denne analysen (100 μL / brønn i en 96-brønnplate), er det av største betydning å ha en ramme av tomme brønner som er fylt med en vandig løsning (dvs. steril destillert H2O eller PBS) rundt analysebrønnene. Dette forhindrer middels fordampning og kanteffekter.
Til slutt, for metabolske analyser (f.eks. ATP-analyser), er det viktig at cellene er levedyktige for å unngå stort standardavvik mellom replikater (figur 5). Høy levedyktighet av cellene er også viktig for sortering av cellene og for videre dyrking av de sorterte p-pillene (figur 4). Denne metoden har imidlertid flere begrensninger. Fullt modne OC-er er svært vedheftende og vanskelige å løsne fra platene. De større OC-ene er ofte umulige å løsne, noe som kan føre til et lavere celleutbytte. Derfor må cellene telles etter sortering og før plating ved ønsket konsentrasjon. Videre brukes i denne protokollen en ikke-enzymatisk metode (accutase) for å løsne p-pillene for å forhindre membranendringer i nedstrøms overflatefarging for flowcytometri. Bruken av celleskrapere (både med myke eller harde endinger) ble også testet og førte til høy celledød. Enzymatisk løsrivelse ved bruk av 0,05 % Trypsin/EDTA-løsninger kan brukes for et høyere utbytte av frittliggende OC-er når membranintegritet ikke er nødvendig for nedstrømsapplikasjoner. I tillegg, for å forhindre at p-pillene klumper seg sammen, anbefales det sterkt å bruke en høy konsentrasjon av EDTA i alle bufferne etter celleløsrivelse, samt passende filtrering før flowcytometrioppkjøp. Det er viktig å merke seg at OC-kulturer er en heterogen populasjon av celler som består av modne OC, OC-forløpere og makrofager. Makrofager kan lett skilles fra OCer, selv om både mononukleære pre-OCs og multinukleære OCs uttrykker OSCAR og ikke kan skilles med dagens metode (figur 4). Faktisk utgjør dette siste problemet hovedbegrensningen for denne metoden. I tillegg er et lavt uttrykk for OSCAR også til stede i M-CSF-kulturer (figur 4B) og kan indikere makrofager som er primet for OC-avstamningsforpliktelse. Det er viktig å stille inn porten for OSCAR+ -celler basert på FMO-fargesignalet, som vist i figur 4B.
Oppsummert beskriver denne protokollen en optimalisert og robust metode for effektiv produksjon av aktive og funksjonelt modne p-piller fra sirkulerende primære humane monocytter. Styrken til denne protokollen er dens evne til å generere OC-er på kort tid og gi et høyt antall differensierte OC-er. Denne metoden åpner for å undersøke de grunnleggende mekanismene som ligger til grunn for OC-differensiering og funksjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner takknemlig Flow Core Facility og Glasgow Imaging Facility (GIF) innen School of Infection and Immunity for deres støtte og assistanse i dette arbeidet.
µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
96-well TC plate | Corning | 3596 | |
96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Acetone | VWR | 20066.330 | |
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher – Invitrogen | A12379 | AF488 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher – Invitrogen | A22287 | AF647 |
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher – Invitrogen | 65-0865-14 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |