Прижизненная визуализация экспрессии флуоресцентных белков у мышей с закрытой черепно-мозговой травмой и краниальным окном с использованием двухфотонного микроскопа
Summary
Это исследование демонстрирует доставку повторяющейся черепно-мозговой травмы мышам и одновременную имплантацию краниального окна для последующей прижизненной визуализации нейрон-экспрессируемого EGFP с помощью двухфотонной микроскопии.
Abstract
Целью этого протокола является демонстрация того, как лонгитюдно визуализировать экспрессию и локализацию интересующего белка в определенных типах клеток мозга животного при воздействии экзогенных стимулов. Здесь показано введение закрытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и одновременная имплантация краниального окна для последующей продольной прижизненной визуализации у мышей. Мышам внутричерепно вводят аденоассоциированный вирус (AAV), экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) под действием нейронно-специфического промотора. Через 2-4 недели мышей подвергают повторной ЧМТ с использованием устройства для сброса веса над местом инъекции AAV. Во время одного хирургического сеанса мышам имплантируют металлический подголовник, а затем стеклянное краниальное окно над местом удара ЧМТ. Экспрессия и клеточная локализация EGFP исследуется с помощью двухфотонного микроскопа в одной и той же области мозга, подвергшейся травме в течение нескольких месяцев.
Introduction
Черепно-мозговая травма (ЧМТ), которая может возникнуть в результате спортивных травм, столкновений транспортных средств и военных действий, является проблемой здравоохранения во всем мире. ЧМТ может привести к физиологическим, когнитивным и поведенческим нарушениям, а также к пожизненной инвалидности или смертности 1,2. Тяжесть ЧМТ можно классифицировать как легкую, умеренную и тяжелую, в подавляющем большинстве случаев это легкая ЧМТ (75%-90%)3. Все чаще признается, что ЧМТ, особенно повторяющиеся случаи ЧМТ, могут способствовать дегенерации нейронов и служить факторами риска развития ряда нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз (БАС), лобно-височную деменцию (ЛВД) и хроническую травматическую энцефалопатию (ХТЭ)4,5,6. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе нейродегенерации, вызванной ЧМТ, остаются неясными и, таким образом, представляют собой активную область исследований. Чтобы получить представление о том, как нейроны реагируют на ЧМТ и восстанавливаются после нее, в данной статье описан метод мониторинга флуоресцентно меченых белков, представляющих интерес, особенно внутри нейронов, с помощью продольной прижизненной визуализации у мышей после ЧМТ.
С этой целью в данном исследовании показано, как сочетать хирургическую процедуру для введения закрытой черепно-мозговой ЧМТ, аналогичную той, о которой сообщалось ранее7,8, с хирургической процедурой имплантации краниального окна для последующей прижизненной визуализации, как описано Goldey et al9. Примечательно, что невозможно сначала имплантировать краниальное окно, а затем выполнить ЧМТ в той же области, так как воздействие падения веса, которое вызывает ЧМТ, может повредить окно и нанести непоправимый вред мыши. Таким образом, этот протокол был разработан для проведения ЧМТ, а затем имплантации краниального окна непосредственно над местом удара, и все это в рамках одного хирургического сеанса. Преимуществом сочетания ЧМТ и имплантации краниального окна в одном хирургическом сеансе является сокращение количества операций, которые мышь подвергается хирургическому вмешательству. Кроме того, это позволяет отслеживать немедленный ответ (т.е. в течение нескольких часов) на ЧМТ, в отличие от имплантации окна на более позднем хирургическом сеансе (т.е. первичная визуализация, начинающаяся в течение нескольких дней после ЧМТ). Краниальное окно и платформа прижизненной визуализации также имеют преимущества по сравнению с мониторингом белков нейронов традиционными методами, такими как иммуноокрашивание фиксированных тканей. Например, для прижизненной визуализации требуется меньшее количество мышей, так как одна и та же мышь может быть изучена в несколько временных точек, в отличие от отдельных когорт мышей, необходимых для дискретных моментов времени. Кроме того, одни и те же нейроны могут контролироваться с течением времени, что позволяет отслеживать конкретные биологические или патологические события в одной и той же клетке.
В качестве доказательства концепции здесь демонстрируется нейрон-специфическая экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под промотором синапсина10. Этот подход может быть распространен на: 1) различные типы клеток головного мозга путем использования других специфических промоторов клеточного типа, таких как промотор основного белка миелина (MBP) для олигодендроцитов и промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для астроцитов11, 2) различные белки-мишени, представляющие интерес, путем слияния их генов с геном EGFP, и 3) коэкспрессия нескольких белков, объединенных с различными флуорофорами. Здесь EGFP упаковывается и экспрессируется путем доставки аденоассоциированного вируса (AAV) через внутричерепную инъекцию. ЧМТ с закрытым черепом проводится с помощью устройства для снижения веса с последующей имплантацией краниального окна. Визуализация нейронального EGFP достигается через краниальное окно с помощью двухфотонной микроскопии для обнаружения флуоресценции EGFP in vivo. С помощью двухфотонного лазера можно проникнуть глубже в кортикальную ткань с минимальным фотоповреждением, что позволяет проводить повторную продольную визуализацию одних и тех же областей коры у отдельной мыши в течение нескольких дней и месяцев12,13,14,15. Таким образом, этот подход, сочетающий операцию ЧМТ с прижизненной визуализацией, направлен на углубление понимания молекулярных событий, которые способствуют патологии, вызванной ЧМТ16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании инъекция AAV, введение ЧМТ и имплантация краниального окна были объединены для анализа продольной визуализации EGFP-меченных нейронов в коре головного мозга мыши (слои IV и V) для наблюдения за влиянием ЧМТ на нейроны коры головного мозга. В этом исследовании отмечается, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Мигеля Сена-Эстевеса из Медицинской школы Чана Массачусетского университета за дарение вируса AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP и Дебру Кэмерон из Медицинской школы Чана Массачусетского университета за рисунок эскиза черепа мыши. Мы также благодарим нынешних и бывших сотрудников лабораторий Bosco, Schafer и Henninger за их предложения и поддержку. Эта работа финансировалась Министерством обороны (W81XWH202071/PRARP) для DAB, DS и NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. 의학. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
