Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons
Summary
Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.
Abstract
O objetivo deste protocolo é demonstrar como visualizar longitudinalmente a expressão e localização de uma proteína de interesse dentro de tipos celulares específicos do cérebro de um animal, mediante exposição a estímulos exógenos. Aqui, a administração de um traumatismo cranioencefálico (TCE) fechado e o implante simultâneo de uma janela craniana para subsequentes imagens intravitais longitudinais em camundongos são mostrados. Camundongos são injetados intracranialmente com um vírus adenoassociado (AAV) expressando proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob um promotor neuronal específico. Após 2 a 4 semanas, os camundongos são submetidos a um TCE repetitivo usando um dispositivo de queda de peso sobre o local de injeção do AAV. Dentro da mesma sessão cirúrgica, os camundongos são implantados com um cabeçote de metal e, em seguida, uma janela craniana de vidro sobre o local do TCE. A expressão e a localização celular do EGFP são examinadas usando um microscópio de dois fótons na mesma região cerebral exposta a trauma ao longo de meses.
Introduction
O traumatismo cranioencefálico (TCE), que pode resultar de lesões esportivas, colisões de veículos e combates militares, é um problema de saúde mundial. O TCE pode levar a déficits fisiológicos, cognitivos e comportamentais, além de incapacidade ou mortalidadeao longo da vida 1,2. A gravidade do TCE pode ser classificada em leve, moderada e grave, sendo a grande maioria TCE leve (75%-90%)3. É cada vez mais reconhecido que o TCE, particularmente as ocorrências repetitivas de TCE, pode promover degeneração neuronal e servir como fatores de risco para várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer (DA), esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT) e encefalopatia traumática crônica (ETC)4,5,6. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração induzida por TCE permanecem obscuros e, portanto, representam uma área ativa de estudo. Para obter informações sobre como os neurônios respondem e se recuperam do TCE, um método para monitorar proteínas fluorescentemente marcadas de interesse, especificamente dentro dos neurônios, por imagens intravitais longitudinais em camundongos após TCE é descrito aqui.
Para tanto, este estudo mostra como combinar um procedimento cirúrgico para a administração de TCE de crânio fechado semelhante ao relatado anteriormente7,8, juntamente com um procedimento cirúrgico para implante de janela craniana para imagem intravital a jusante, como descrito por Goldey e cols.9. Notadamente, é inviável implantar uma janela craniana primeiro e, posteriormente, realizar um TCE na mesma região, pois o impacto da queda de peso que induz o TCE é suscetível de danificar a janela e causar danos irreparáveis ao camundongo. Portanto, esse protocolo foi desenhado para administrar o TCE e, em seguida, implantar a janela craniana diretamente sobre o local do impacto, tudo dentro da mesma sessão cirúrgica. Uma vantagem de combinar o TCE e o implante de janela craniana em uma única sessão cirúrgica é a redução do número de vezes que um camundongo é submetido à cirurgia. Além disso, permite monitorar a resposta imediata (ou seja, na escala de tempo de horas) ao TCE, em vez de implantar a janela em uma sessão cirúrgica posterior (ou seja, imagens iniciais iniciadas em uma escala de tempo de dias pós-TCE). A janela craniana e a plataforma de imagem intravital também oferecem vantagens sobre a monitorização de proteínas neuronais por métodos convencionais, como a imunomarcação de tecidos fixos. Por exemplo, menos camundongos são necessários para imagens intravitais, já que o mesmo camundongo pode ser estudado em vários pontos de tempo, em oposição a coortes separadas de camundongos necessárias para pontos de tempo discretos. Além disso, os mesmos neurônios podem ser monitorados ao longo do tempo, permitindo rastrear eventos biológicos ou patológicos específicos dentro da mesma célula.
Como prova de conceito, a expressão neurônio-específica da proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob o promotor de sinapsina é demonstrada aqui10. Essa abordagem pode ser estendida para 1) diferentes tipos de células cerebrais utilizando outros promotores específicos de tipos celulares, como promotor de proteína básica de mielina (MBP) para oligodendrócitos e promotor de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para astrócitos11 , 2) diferentes proteínas-alvo de interesse pela fusão de seus genes com o gene EGFP e 3) co-expressão de múltiplas proteínas fundidas a diferentes fluoróforos. Aqui, o EGFP é embalado e expresso através da administração de vírus adenoassociado (AAV) através de uma injeção intracraniana. Um TCE de crânio fechado é administrado usando um dispositivo de queda de peso, seguido pelo implante de uma janela craniana. A visualização do EGFP neuronal é obtida através da janela craniana, usando microscopia de dois fótons para detectar a fluorescência do EGFP in vivo. Com o laser de dois fótons, é possível penetrar mais profundamente no tecido cortical com o mínimo de fotodano, permitindo repetidas imagens longitudinais das mesmas regiões corticais dentro de um camundongo individual por dias e até meses12,13,14,15. Em suma, essa abordagem de combinação de cirurgia de TCE com imagem intravital visa avançar no entendimento dos eventos moleculares que contribuem para a patologia da doença induzida por TCE16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, a injeção de AAV, a administração de TCE e um cabeçote com implante de janela craniana foram combinados para análise de imagem longitudinal de neurônios marcados com EGFP dentro do córtex cerebral de camundongos (camadas IV e V) para observar os efeitos do TCE nos neurônios corticais. Este estudo observa que o local do TCE aqui escolhido, acima do hipocampo, fornece uma superfície relativamente plana e ampla para a implantação da janela craniana. Por outro lado, o crânio é relativamente estrei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Miguel Sena-Esteves, da University of Massachusetts Chan Medical School, por presentear o vírus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e a Debra Cameron, da University of Massachusetts Chan Medical School, por desenhar o esboço do crânio de camundongos. Agradecemos também aos membros atuais e passados dos laboratórios Bosco, Schafer e Henninger por suas sugestões e apoio. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS e NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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