Her præsenterer vi en protokol til høst af klæbende celler fra flerlagskolber på en lukket halvautomatisk måde ved hjælp af et modstrømscentrifugeringssystem. Denne protokol kan anvendes til høst af både vedhængende og suspensionsceller fra andre celleudvidelsesplatforme med få ændringer af de eksisterende trin.
Humane mesenkymale stamceller (hMSC’er) undersøges i øjeblikket som en lovende cellebaseret terapeutisk modalitet til forskellige sygdomme, og der forventes flere markedsgodkendelser til klinisk brug i løbet af de næste par år. For at lette denne overgang er det afgørende at tackle flaskehalse i skala, lot-to-lot reproducerbarhed, omkostninger, overholdelse af lovgivningen og kvalitetskontrol. Disse udfordringer kan løses ved at lukke processen og indføre automatiserede produktionsplatforme. I denne undersøgelse udviklede vi en lukket og halvautomatisk proces til passering og høst af Whartons gelé (WJ)-afledte hMSC’er (WJ-hMSC’er) fra flerlagskolber ved hjælp af modstrømscentrifugering. WJ-hMSC’erne blev udvidet ved hjælp af regulatorisk kompatibelt serumfrit xenofrit (SFM XF) medium, og de viste sammenlignelig celleproliferation (populationsfordobling) og morfologi med WJ-hMSC’er udvidet i klassiske serumholdige medier. Vores lukkede halvautomatiske høstprotokol viste høj cellegendannelse (~ 98%) og levedygtighed (~ 99%). Cellerne vasket og koncentreret ved hjælp af modstrømscentrifugering opretholdt WJ-hMSC overflademarkørekspression, kolonidannende enheder (CFU-F), trilineagedifferentieringspotentiale og cytokinsekretionsprofiler. Den halvautomatiske cellehøstningsprotokol, der er udviklet i undersøgelsen, kan let anvendes til behandling i lille til mellemstor skala af forskellige vedhængende celler og suspensionsceller ved direkte forbindelse til forskellige celleudvidelsesplatforme for at udføre volumenreduktion, vask og høst med et lavt outputvolumen.
Humane mesenkymale stamceller (hMSC’er) er en god kandidat til kliniske anvendelser, både inden for vævsteknik og i celleterapier, i betragtning af deres terapeutiske potentiale og høje selvfornyelsespotentiale til at vokse in vitro, hvilket er afgørende for at generere klinisk relevante doser af celler 1,2,3. Ifølge ClinicalTrials.gov er der over 1.000 kliniske forsøg i øjeblikket under undersøgelse for forskellige sygdomstilstande4. På baggrund af den stigende interesse for at bruge hMSC’er er flere kliniske forsøg og markedsgodkendelser nært forestående i den nærmeste fremtid 5,6. Fremstillingen af hMSC’er har imidlertid mange iboende udfordringer med hensyn til batch-til-batch-variabilitet, brugen af højrisikoråmaterialer, bekymringer vedrørende forurening på grund af mange åbne og manuelle processer, da fremstillingen involverer flere enhedsoperationer, højere lønomkostninger, omkostningerne ved udskalering eller opskalering og lovgivningsmæssige forhindringer 6,7,8,9,10, 11,12. Disse spørgsmål er fortsat en væsentlig hindring for nuværende og fremtidig markedsadgang.
Udviklingen af lukkede, modulopbyggede, automatiserede produktionsløsninger og anvendelse af lavrisikohjælpereagenser vil løse disse udfordringer. Dette vil også sikre ensartet produktkvalitet, mindske sandsynligheden for batchfejl på grund af menneskelige fejl, reducere lønomkostningerne og forbedre processtandardisering og overholdelse af lovgivningen, f.eks.med hensyn til digital batchregistrering 8,12,13,14. For at kunne opnå en klinisk relevant dosering af celler, det være sig autolog eller allogen, strømlinet fremstilling, der involverer opstrøms celleudvidelse og nedstrømsbehandling på en lukket, automatiseret måde, er afgørende.
Til opstrøms hMSC-ekspansion er de to mest almindelige fremstillingsmetoder, der i øjeblikket anvendes, udskalering (2D-monolag) og opskalering (3D-mikrobærerbaseret affjedringssystem)15,16,17,18. Den mest traditionelle og udbredte metode til hMSC-udvidelse er 2D-monolagsbaseret kultur på grund af de lave produktionsomkostninger og den nemme opsætning19.
Flerlagskolber bestående af bakker med flade overflader stablet i et dyrkningskar bruges almindeligvis til at udskalere hMSC-produktionen. Disse systemer leveres typisk i 1-lags til 40-lags kulturbeholdere20 og håndteres manuelt inde i biosikkerhedsskabe. Behandlingstrinnene under cellegennemløb og høstning involverer manuel dispensering og dekantering af ekspansionsmediet, dissociationsreagenset og vaskebufferen ved pipettering eller fysisk vipning af hele beholderen. Desuden er håndtering af flere enheder udfordrende og tidskrævende på grund af deres store størrelse og vægt.
Derefter er efterhøstning fra flerlagskolber, centrifugering til medieudveksling, cellevask og volumenreduktion vigtige trin på tværs af hele cellefremstillingsarbejdsgangen21. Konventionel bordcentrifugering er en for det meste åben og manuel proces, der involverer en lang række trin, såsom overførsel af cellesuspensionen til lukkede rør eller flasker inde i et biosikkerhedsskab, spinding af cellerne, manuel aspirering af supernatanten, celleopslæmning med bufferen og gentagne cellevask. Dette øger dramatisk både risikoen for kontaminering på grund af åbning og lukning af hætterne og chancerne for at miste cellepelleten under den manuelle aspirations-/pipetteringsproces22. I forbindelse med håndtering af flerlags kultursystemer til vedhængende celler såsom hMSC’er skal operatøren gennemgå en besværlig proces med at skifte mellem centrifugen og biosikkerhedsskabet gentagne gange og håndtere en tung enhed på samme tid. Disse manuelle trin er besværlige, udgør risici med hensyn til menneskelige fejl og kontaminering og skal udføres i et renrumsmiljø i klasse B, hvilket er dyrt23. Derudover er den konventionelle manuelle centrifugeringsproces ikke skalerbar og kan forårsage cellulær forskydning og stress; Således er maksimering af cellegenvinding, levedygtighed og udvaskningseffektiviteten af resterende urenheder andre store udfordringer22. Kommerciel cGMP-skalafremstilling af celleterapier kræver lukkede, modulære automatiseringsløsninger for at reducere risikoen for kontaminering, sikre ensartet produktkvalitet, reducere arbejds- og produktionsomkostninger og øge procespålideligheden24,25. Flerlagskolber kan håndteres som et lukket system ved at have et sterilt 0,2 μm filter i en af portene for at lette steril gasudveksling og en anden port aseptisk forbundet via stik eller rørsvejset direkte til et automatiseret cellebehandlingsinstrument til cellehøstning. Vi arbejdede hen imod at lukke og automatisere de fleste trin i WJ-hMSC-passering og høst ved at evaluere en innovativ lukket modstrømscentrifuge beregnet til fremstilling af celle-, gen- eller vævsbaserede produkter. Denne modstrømscentrifuge har også fleksibiliteten til at udføre en række cellebehandlingsapplikationer, såsom celleseparation baseret på størrelse, medium / bufferudveksling, koncentration og høst for en række celletyper 8,26,27,28. Instrumentet bruger et lukket engangssæt, der kan tilsluttes sterilt ved hjælp af rørsvejsning eller aseptiske stik til overførsel af poser eller kan tilsluttes direkte til enhver ekspansionsplatform efter eget valg.
I denne undersøgelse designede vi en brugerdefineret slangesamling for at muliggøre lukkede sterile forbindelser mellem engangsmodstrømscentrifugeringssættet og flerlagskolben. Vi optimerede en protokol til enzymatisk afmontering, vask og høst af WJ-MSC’er fra flerlagskolben på en helt lukket og halvautomatisk måde inden for en enkelt kørsel. De høstede WJ-hMSC’er blev karakteriseret for renhed (overflademarkøranalyse) og styrke (CFU-F, trilineagedifferentiering og cytokinsekretionsprofiler) for at sikre, at det endelige produkt opfyldte de kritiske kvalitetsattributter (CQA’er) for batchfrigivelse.
I dette arbejde har vi vist evnen til at lukke og semiautomatisere hMSC-dissociation og vaske og høste på bænken ved hjælp af et modstrømscentrifugeringsinstrument. Et af de kritiske trin i hele arbejdsgangen er at sikre, at slangerne er forbundet i henhold til den forudindstillede protokol, der er defineret i modstrømscentrifugeringssystemprotokolbyggeren. Opsætningen og betjeningen er enkel, og den tid, det tog at behandle omkring 2 liter kultur fra en 10-lags kolbe fra kitsamling til cellehøst, var omkring 60 minutter. Et af de begrænsende trin i denne arbejdsgang er væskeoverførslen fra flerlagskolben til overførselsposerne, der er forbundet med modstrømscentrifugeringsinstrumentet. High-flow engangssættet kan kun køres med en maksimal flowhastighed på 165 ml/min, og dette kan være en udfordring for behandling af f.eks. en 40-lags kolbe. For at fremskynde processen med væskeoverførsel kan eksterne højstrømspumper bruges til først at overføre det trypsiniserede indhold til en overførselspose, efterfulgt af vask/koncentrering og høstning af cellerne fra overførselsposen ved hjælp af modstrømscentrifugeringssystemet. Desuden kan denne protokol også anvendes til at passere celler fra 4-lags til 10-lags flerlagskolber. Længere opstrøms kunne modstrømscentrifugeringssystemet også optimeres til vask af optøede hMSC’er og direkte høst og mediumformulering i flerlagskolber for at starte frøstammen. Det skal bemærkes, at det mindste antal celler, der kræves for at danne det fluidiserede leje i modstrømscentrifugeringskammeret, er ca. 30 millioner celler, og det maksimale anbefalede volumen, der skal behandles pr. Batch, er 20 L.
I øjeblikket er fastgørelse af den brugerdefinerede slangeenhed til flerlagskolben i biosikkerhedsskabet og autoklavering af komponenternes dele ikke ønskelig i en cGMP-indstilling. Som et alternativ kunne en brugerdefineret gammasteriliseret rørsamling outsources til leverandører. Leverandører, der leverer flerlagskolber, tilbyder også mulighed for at formontere kolberne med ønskede slangesamlinger, herunder et 0,2 μm filter og gammasterilisering af hele udstyret. Dette ville sikre, at flerlagskolberne og de påsatte slanger virkelig er lukkede, hvilket betyder, at processen kan afsluttes på bænken i et renrum i klasse C.
Denne proces, der anvender modstrømscentrifugeringssystemet, er ikke begrænset til vedhængende baserede dyrkede celler i en flerlagsbeholder og kan tilpasses dynamiske (omrørte tank- eller bølgebioreaktorer) og statiske (gasgennemtrængelige) suspensionsbaserede celleudvidelsesplatforme. Specifikt for hMSC’er, der er udvidet i 3D-mikrobærerkulturer, kan protokoller optimeres på modstrømscentrifugeringssystemet til at høste, vaske og formulere hMSC’erne adskilt fra mikrobærere.
Samlet set har stigende interesse for at udvikle translationelle cellulære terapier med forbedret procesrobusthed og pålidelighed ført til udviklingen af lukkede, automatiserede cellebehandlingsplatforme. Disse systemer er bydende nødvendige, da de reducerer antallet af håndteringstrin, forhindrer potentiel kontaminering af sterile forbindelser og reducerer produktionsomkostningerne ved at reducere arbejdskraften og forbedre den effektive brug af renrumsplads21. I tråd med dette er mange af de udviklere af celleterapiprodukter, der søger myndighedsgodkendelse til at oversætte deres terapier, opmærksomme på vigtigheden af at lukke processen og implementere fuld automatisering eller semiautomatisering allerede i procesudviklingsfasen 14,31,32.
Med brugen af regulatorisk venligt SFM XF-medium og sammen med hjælpereagenser, der er i overensstemmelse med 21 CFR GMP Part 11 og internationale kvalitetsretningslinjer, ville denne halvautomatiske proces være let egnet til klinisk fremstilling. Vi har vist reproducerbarheden af den lukkede proces og opretholdelsen af kvaliteten af WJ-MSC’erne. Forbedring af effektiviteten og sikkerheden ved dyrkning af klæbende celler i flerlagskolber ville ikke kun gavne hMSC-terapiområdet, men også virksomheder inden for cellelinjebank og vedhængende virusproduktion.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) finansiering (H18/01/a0/021 og H18/AH/a0/001) fra A * STAR, Singapore.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |