Ici, nous présentons un protocole pour récolter les cellules adhérentes des flacons multicouches de manière semi-automatisée fermée à l’aide d’un système de centrifugation à contre-courant. Ce protocole peut être appliqué pour récolter à la fois des cellules adhérentes et des cellules en suspension à partir d’autres plates-formes d’expansion cellulaire avec peu de modifications aux étapes existantes.
Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) sont actuellement explorées en tant que modalité thérapeutique cellulaire prometteuse pour diverses maladies, avec d’autres approbations de mise sur le marché pour une utilisation clinique attendues au cours des prochaines années. Pour faciliter cette transition, il est essentiel de s’attaquer aux goulots d’étranglement liés à l’échelle, à la reproductibilité d’un lot à l’autre, au coût, à la conformité réglementaire et au contrôle de la qualité. Ces défis peuvent être relevés en fermant le processus et en adoptant des plates-formes de fabrication automatisées. Dans cette étude, nous avons développé un processus fermé et semi-automatisé pour le passage et la récolte des hMSC dérivés de la gelée de Wharton (WJ-hMSC) à partir de flacons multicouches à l’aide de la centrifugation à contre-courant. Les CSMhMS WJ ont été étendues en utilisant un milieu sans sérum sans sérum (SFM XF) conforme à la réglementation, et elles ont montré une prolifération cellulaire (doublement de la population) et une morphologie comparables à celles des CSE-WJ développées dans des milieux contenant du sérum classiques. Notre protocole de récolte semi-automatisé fermé a démontré une récupération cellulaire élevée (~98%) et une viabilité (~99%). Les cellules lavées et concentrées par centrifugation à contre-flux ont maintenu l’expression du marqueur de surface WJ-hMSC, les unités formant colonie (UFC-F), le potentiel de différenciation trilignée et les profils de sécrétion de cytokines. Le protocole de récolte de cellules semi-automatisé développé dans l’étude peut être facilement appliqué pour le traitement à petite et moyenne échelle de diverses cellules adhérentes et en suspension en se connectant directement à différentes plates-formes d’expansion cellulaire pour effectuer une réduction de volume, un lavage et une récolte avec un faible volume de sortie.
Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) sont un excellent candidat pour des applications cliniques, à la fois en génie tissulaire et en thérapies cellulaires, compte tenu de leur potentiel thérapeutique et de leur potentiel élevé d’auto-renouvellement pour se développer in vitro, qui sont essentiels pour générer des doses cliniquement pertinentes de cellules 1,2,3. Selon ClinicalTrials.gov, plus de 1 000 essais cliniques sont actuellement à l’étude pour diverses affectionspathologiques 4. Compte tenu de l’intérêt croissant pour l’utilisation des CSMh, davantage d’essais cliniques et d’autorisations de mise sur le marché sont imminents dans un avenir proche 5,6. Cependant, la fabrication des CSMh présente de nombreux défis inhérents en termes de variabilité d’un lot à l’autre, d’utilisation de matières premières à haut risque, de préoccupations concernant la contamination due à de nombreux processus ouverts et manuels, car la fabrication implique des opérations à unités multiples, des coûts de main-d’œuvre plus élevés, le coût de la mise à l’échelle ou de la mise à l’échelle, et les obstacles réglementaires 6,7,8,9,10, 11,12. Ces questions demeurent un obstacle important à l’accès actuel et futur aux marchés.
Le développement de solutions de fabrication fermées, modulaires et automatisées et l’utilisation de réactifs auxiliaires à faible risque permettraient de relever ces défis. Cela garantirait également une qualité constante des produits, réduirait la probabilité de défaillances des lots dues à une erreur humaine, réduirait les coûts de main-d’œuvre et améliorerait la normalisation des processus et la conformité réglementaire, par exemple en termes de tenue de registres numériques des lots 8,12,13,14. Pour pouvoir obtenir un dosage cliniquement pertinent de cellules, qu’il s’agisse d’une fabrication autologue ou allogénique, une fabrication rationalisée impliquant une expansion cellulaire en amont et un traitement en aval de manière fermée et automatisée est cruciale.
Pour l’expansion des hMSC en amont, les deux méthodes de fabrication les plus couramment utilisées actuellement sont le scale-out (monocouche 2D) et le scale-up (système de suspension 3D à base de microporteur)15,16,17,18. La méthode la plus traditionnelle et la plus largement adoptée pour l’expansion hMSC est la culture monocouche 2D en raison du faible coût de production et de la facilité de configuration19.
Des flacons multicouches composés de plateaux à surface plane empilés dans un récipient de culture sont couramment utilisés pour augmenter la production de hMSC. Ces systèmes sont généralement livrés dans des récipients de culture de 1 à 40 couches20 et sont manipulés manuellement à l’intérieur des armoires de biosécurité. Les étapes de traitement pendant le passage et la récolte des cellules impliquent la distribution et la décantation manuelles du milieu d’expansion, du réactif de dissociation et du tampon de lavage par pipetage ou inclinaison physique de l’ensemble du récipient. En outre, la manipulation de plusieurs unités est difficile et prend beaucoup de temps en raison de leur taille et de leur poids.
Par la suite, la post-récolte à partir de flacons multicouches, la centrifugation pour l’échange de fluides, le lavage des cellules et la réduction du volume sont des étapes essentielles tout au long du flux de travail de fabricationdes cellules 21. La centrifugation conventionnelle de paillasse est un processus principalement ouvert et manuel qui implique une multitude d’étapes, telles que le transfert de la suspension cellulaire dans des tubes ou des bouteilles coiffés à l’intérieur d’une armoire de biosécurité, la rotation des cellules, l’aspiration manuelle du surnageant, la remise en suspension des cellules avec le tampon et les lavages répétés des cellules. Cela augmente considérablement à la fois le risque de contamination due à l’ouverture et à la fermeture des bouchons et les risques de perte de la pastille cellulaire pendant le processus d’aspiration manuelle / pipetage22. Dans le contexte de la manipulation de systèmes de culture multicouches pour les cellules à base d’adhérents telles que les CSMh, l’opérateur devrait passer par un processus laborieux de navette entre la centrifugeuse et l’armoire de biosécurité à plusieurs reprises et de manipulation simultanée d’une unité lourde. Ces étapes manuelles sont laborieuses, présentent des risques en termes d’erreurs humaines et de contamination, et doivent être effectuées dans un environnement de salle blanche de classe B, ce qui est coûteux23. De plus, le processus de centrifugation manuelle conventionnel n’est pas évolutif et pourrait provoquer un cisaillement cellulaire et un stress; Ainsi, maximiser la récupération cellulaire, la viabilité et l’efficacité de lavage des impuretés résiduelles sont d’autres défis majeurs22. La fabrication commerciale de thérapies cellulaires à l’échelle cGMP nécessite des solutions d’automatisation modulaires fermées pour réduire le risque de contamination, assurer une qualité constante des produits, réduire les coûts de main-d’œuvre et de production et augmenter la fiabilité des processus24,25. Les flacons multicouches peuvent être manipulés comme un système fermé en ayant un filtre stérile de 0,2 μm dans l’un des orifices pour faciliter l’échange de gaz stérile et un deuxième orifice connecté de manière aseptique via des connecteurs ou soudé directement à un instrument de traitement automatisé des cellules pour la récolte des cellules. Nous avons travaillé à la fermeture et à l’automatisation de la plupart des étapes du passage et de la récolte WJ-hMSC en évaluant une centrifugeuse à contre-courant fermée innovante destinée à la fabrication de produits à base de cellules, de gènes ou de tissus. Cette centrifugeuse à contre-courant a également la flexibilité nécessaire pour effectuer une variété d’applications de traitement cellulaire, telles que la séparation cellulaire basée sur la taille, l’échange milieu/tampon, la concentration et la récolte pour une variété de types cellulaires 8,26,27,28. L’instrument utilise un kit fermé à usage unique qui peut être connecté stérile à l’aide de soudage de tubes ou de connecteurs aseptiques pour transférer des sacs ou peut être connecté directement à n’importe quelle plate-forme d’expansion de votre choix.
Dans cette étude, nous avons conçu un ensemble de tubes sur mesure pour permettre des connexions stériles fermées entre le kit de centrifugation à contre-courant à usage unique et le ballon multicouche. Nous avons optimisé un protocole pour détacher, laver et récolter par voie enzymatique les CME-WJ du flacon multicouche de manière entièrement fermée et semi-automatisée en une seule fois. Les CSE-WJ-hMSC récoltées ont été caractérisées pour leur pureté (analyse des marqueurs de surface) et leur puissance (UFC-F, différenciation trilignée et profils de sécrétion de cytokines) afin de s’assurer que le produit final répondait aux attributs de qualité critiques (AQC) pour la libération des lots.
Dans ce travail, nous avons montré la capacité de fermer et de semi-automatiser la dissociation hMSC et de laver et récolter sur le banc à l’aide d’un instrument de centrifugation à contre-courant. L’une des étapes critiques de l’ensemble du flux de travail consiste à s’assurer que les tubes sont connectés conformément au protocole prédéfini défini dans le générateur de protocole du système de centrifugation à contre-courant. La configuration et le fonctionnement sont simples, et le temps nécessaire pour traiter environ 2 L de culture à partir d’un ballon à 10 couches, de l’assemblage du kit à la récolte cellulaire, était d’environ 60 min. L’une des étapes limitantes de ce flux de travail est le transfert de fluide du ballon multicouche aux sacs de transfert connectés à l’instrument de centrifugation à contre-courant. La trousse à usage unique à haut débit ne peut fonctionner qu’à un débit maximal de 165 mL/min, ce qui peut être difficile pour le traitement, par exemple, d’un ballon à 40 couches. Pour accélérer le processus de transfert de fluide, des pompes externes à haut débit peuvent être utilisées pour transférer d’abord le contenu trypsinisé dans un sac de transfert, puis pour laver/concentrer et récolter les cellules du sac de transfert à l’aide du système de centrifugation à contre-courant. De plus, ce protocole peut également être appliqué pour les cellules passagères de flacons multicouches à 4 couches à 10 couches. Plus en amont, le système de centrifugation à contre-courant pourrait également être optimisé pour le lavage des hMSC décongelés et la récolte directe et la formulation moyenne dans des flacons multicouches pour démarrer le train de semences. Il convient de noter que le nombre minimum de cellules nécessaires pour former le lit fluidisé dans la chambre de centrifugation à contre-courant est d’environ 30 millions de cellules, et le volume maximal recommandé à traiter par lot est de 20 L.
À l’heure actuelle, la fixation de l’ensemble de tubes sur mesure au ballon multicouche de l’enceinte de biosécurité et l’autoclavage des parties des composants ne sont pas souhaitables dans un cadre cGMP. Comme alternative, un ensemble de tubes stérilisés aux rayons gamma sur mesure pourrait être sous-traité à des fournisseurs. Les fournisseurs fournissant des flacons multicouches offrent également la possibilité de pré-ajuster les flacons avec les assemblages de tubes souhaités, y compris un filtre de 0,2 μm, et la stérilisation gamma de l’ensemble de l’équipement. Cela garantirait que les flacons multicouches et les tubes fixés sont vraiment fermés, ce qui signifie que le processus pourrait être complété sur le banc dans une salle blanche de classe C.
Ce procédé utilisant le système de centrifugation à contre-courant ne se limite pas aux cellules cultivées à base d’adhérents dans un récipient multicouche et pourrait être adapté aux plates-formes d’expansion de cellules dynamiques (réservoirs agités ou à vagues) et statiques (perméables aux gaz). Plus précisément, pour les hMSC étendus dans des cultures de microporteurs 3D, les protocoles peuvent être optimisés sur le système de centrifugation à contre-courant pour récolter, laver et formuler les hMSC dissociés des microporteurs.
Dans l’ensemble, l’intérêt croissant pour le développement de thérapies cellulaires translationnelles avec une robustesse et une fiabilité de processus améliorées a conduit au développement de plates-formes de traitement cellulaire fermées et automatisées. Ces systèmes sont impératifs, car ils réduisent le nombre d’étapes de manipulation, préviennent la contamination potentielle par des connexions stériles et réduisent les coûts de fabrication en réduisant la main-d’œuvre et en améliorant l’utilisation efficace de l’espace des salles blanches21. Dans cette optique, de nombreux développeurs de produits de thérapie cellulaire qui cherchent à obtenir l’approbation réglementaire pour traduire leurs thérapies sont conscients de l’importance de fermer le processus et de mettre en œuvre une automatisation complète ou une semi-automatisation dès l’étape de développement du processus 14,31,32.
Avec l’utilisation d’un milieu SFM XF respectueux de la réglementation, et avec des réactifs auxiliaires conformes à 21 CFR GMP Part 11 et aux directives internationales de qualité, ce processus semi-automatisé serait facilement adapté à la fabrication clinique. Nous avons montré la reproductibilité du processus fermé et le maintien de la qualité des WJ-MSC. L’amélioration de l’efficacité et de la sécurité de la culture de cellules à base d’adhérents dans des flacons multicouches profiterait non seulement au domaine de la thérapie hMSC, mais aussi aux entreprises de la banque de lignées cellulaires et de la production de virus adhérents.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le soutien du financement du Fonds d’alignement de l’industrie (IAF-PP) (H18/01/a0/021 et H18/AH/a0/001) de A*STAR, Singapour.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |