यहां, हम एक काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके बंद अर्ध-स्वचालित तरीके से बहु-स्तरीय फ्लास्क से अनुयायी कोशिकाओं की कटाई के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल को मौजूदा चरणों में कुछ संशोधनों के साथ अन्य सेल विस्तार प्लेटफार्मों से अनुयायी और निलंबन दोनों कोशिकाओं की कटाई के लिए लागू किया जा सकता है।
मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) को वर्तमान में विभिन्न बीमारियों के लिए एक आशाजनक सेल-आधारित चिकित्सीय पद्धति के रूप में खोजा जा रहा है, जिसमें अगले कुछ वर्षों में नैदानिक उपयोग के लिए अधिक बाजार अनुमोदन की उम्मीद है। इस संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए, पैमाने, लॉट-टू-लॉट प्रजनन क्षमता, लागत, नियामक अनुपालन और गुणवत्ता नियंत्रण की बाधाओं को संबोधित करना महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया को बंद करके और स्वचालित विनिर्माण प्लेटफार्मों को अपनाकर इन चुनौतियों का समाधान किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हमने काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके बहु-स्तरीय फ्लास्क से व्हार्टन जेली (डब्ल्यूजे)-व्युत्पन्न एचएमएससी (डब्ल्यूजे-एचएमएससी) को पारित करने और कटाई के लिए एक बंद और अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया विकसित की। डब्ल्यूजे-एचएमएससी को नियामक अनुरूप सीरम-मुक्त क्सीन-मुक्त (एसएफएम एक्सएफ) माध्यम का उपयोग करके विस्तारित किया गया था, और उन्होंने क्लासिक सीरम युक्त मीडिया में विस्तारित डब्ल्यूजे-एचएमएससी के लिए तुलनीय सेल प्रसार (जनसंख्या दोगुनी) और आकृति विज्ञान दिखाया। हमारे बंद अर्ध-स्वचालित कटाई प्रोटोकॉल ने उच्च सेल रिकवरी (~ 98%) और व्यवहार्यता (~ 99%) का प्रदर्शन किया। काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके धोए गए और केंद्रित कोशिकाओं ने डब्ल्यूजे-एचएमएससी सतह मार्कर अभिव्यक्ति, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू-एफ), त्रिवंश भेदभाव क्षमता और साइटोकिन स्राव प्रोफाइल को बनाए रखा। अध्ययन में विकसित अर्ध-स्वचालित सेल हार्वेस्टिंग प्रोटोकॉल को कम उत्पादन मात्रा के साथ मात्रा में कमी, धुलाई और कटाई करने के लिए विभिन्न सेल विस्तार प्लेटफार्मों से सीधे जुड़कर विभिन्न अनुयायी और निलंबन कोशिकाओं के छोटे से मध्यम पैमाने पर प्रसंस्करण के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।
मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) ऊतक इंजीनियरिंग और सेल थेरेपी दोनों में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक महान उम्मीदवार हैं, उनकी चिकित्सीय क्षमता और विट्रो में बढ़ने के लिए उच्च आत्म-नवीकरण क्षमता को देखते हुए,जो कोशिकाओं के नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। ClinicalTrials.gov अनुसार, वर्तमान में विभिन्नरोग स्थितियों के लिए 1,000 से अधिक नैदानिक परीक्षण ों की जांच चल रही है। एचएमएससी का उपयोग करने में बढ़ती रुचि की पृष्ठभूमि को देखते हुए,निकट भविष्य में अधिक नैदानिक परीक्षण और बाजार अनुमोदन आसन्न हैं। हालांकि, एचएमएससी के विनिर्माण में बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता, उच्च जोखिम वाले कच्चे माल के उपयोग, कई खुली और मैनुअल प्रक्रियाओं के कारण संदूषण के बारे में चिंताओं के संदर्भ में कई अंतर्निहित चुनौतियां हैं, क्योंकि विनिर्माण में कई इकाई संचालन, उच्च श्रम लागत, स्केलिंग या स्केलिंग की लागत और नियामक बाधाएं 6,7,8,9,10 शामिल हैं। 11,12. ये मुद्दे वर्तमान और भविष्य के बाजार पहुंच के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बने हुए हैं।
बंद, मॉड्यूलर, स्वचालित विनिर्माण समाधानों का विकास और कम जोखिम वाले सहायक अभिकर्मकों का उपयोग इन चुनौतियों का समाधान करेगा। यह लगातार उत्पाद की गुणवत्ता सुनिश्चित करेगा, मानव त्रुटि के कारण बैच विफलताओं की संभावना को कम करेगा, श्रम लागत को कम करेगा, और प्रक्रिया मानकीकरण और नियामक अनुपालन में सुधार करेगा, जैसे कि डिजिटल बैच रिकॉर्ड रखने के संदर्भ में 8,12,13,14। कोशिकाओं की चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक खुराक प्राप्त करने में सक्षम होने के लिए, चाहे वह ऑटोलॉगस या एलोजेनिक हो, सुव्यवस्थित विनिर्माण जिसमें अपस्ट्रीम सेल विस्तार और बंद, स्वचालित तरीके से डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण शामिल है, महत्वपूर्ण है।
अपस्ट्रीम एचएमएससी विस्तार के लिए, वर्तमान में नियोजित दो सबसे आम विनिर्माण विधियां स्केल-आउट (2 डी मोनोलेयर) और स्केल-अप (3 डी माइक्रोकैरियर-आधारित निलंबन प्रणाली) 15,16,17,18 हैं। एचएमएससी विस्तार के लिए सबसे पारंपरिक और व्यापक रूप से अपनाई जाने वाली विधि कम उत्पादन लागत और सेटअपमें आसानी के कारण 2 डी मोनोलेयर-आधारित संस्कृति है।
एक कल्चर पोत के भीतर स्टैक किए गए फ्लैट सतह ट्रे से बने बहु-स्तरित फ्लास्क का उपयोग आमतौर पर एचएमएससी उत्पादन को बढ़ाने के लिए किया जाता है। ये सिस्टम आमतौर पर 1-परत से 40-परत संस्कृति जहाजों20 में आते हैं और जैव सुरक्षा अलमारियों के अंदर मैन्युअल रूप से नियंत्रित होते हैं। सेल पासिंग और कटाई के दौरान प्रसंस्करण चरणों में विस्तार मीडिया, पृथक्करण अभिकर्मक को मैन्युअल रूप से वितरित करना और डिकेनिंग करना और पूरे पोत को पाइपिंग या शारीरिक रूप से झुकाकर वॉश बफर शामिल है। इसके अलावा, कई इकाइयों को संभालना उनके सरासर आकार और वजन के कारण चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला है।
इसके बाद, बहु-स्तरीय फ्लास्क से कटाई के बाद, मीडिया एक्सचेंज के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन, सेल वॉश और वॉल्यूम में कमी पूरे सेल विनिर्माण वर्कफ़्लो21 में आवश्यक कदम हैं। पारंपरिक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूजेशन एक ज्यादातर खुली और मैनुअल प्रक्रिया है जिसमें कई कदम शामिल होते हैं, जैसे कि सेल निलंबन को बायोसेफ्टी कैबिनेट के अंदर कैप्ड ट्यूब या बोतलों में स्थानांतरित करना, कोशिकाओं को घुमाना, सुपरनैटेंट को मैन्युअल रूप से घुमाना, बफर के साथ सेल रिसस्पेंशन, और बार-बार सेल धोना। यह नाटकीय रूप से कैप्स के खुलने और बंद होने के कारण संदूषण के जोखिम और मैनुअल एस्पिरेशन / पाइपिंगप्रक्रिया के दौरान सेल पेलेट को खोने की संभावना दोनों को बढ़ाता है। एचएमएससी जैसे अनुयायी-आधारित कोशिकाओं के लिए बहु-स्तरीय संस्कृति प्रणालियों को संभालने के संदर्भ में, ऑपरेटर को सेंट्रीफ्यूज और जैव सुरक्षा कैबिनेट के बीच बार-बार बंद करने और एक ही समय में एक भारी इकाई को संभालने की श्रमसाध्य प्रक्रिया से गुजरना होगा। ये मैनुअल कदम श्रमसाध्य हैं, मानव त्रुटियों और संदूषण के संदर्भ में जोखिम पैदा करते हैं, और इसे क्लास बी के स्वच्छ कमरे के वातावरण में आयोजित किया जाना है,जो महंगा है। इसके अलावा, पारंपरिक मैनुअल सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया स्केलेबल नहीं है और सेलुलर कतरनी और तनाव का कारण बन सकती है; इस प्रकार, सेल रिकवरी, व्यवहार्यता और अवशिष्ट अशुद्धियों की वॉश-आउट दक्षता को अधिकतम करना अन्यप्रमुख चुनौतियां हैं। सेल थेरेपी के वाणिज्यिक सीजीएमपी स्केल विनिर्माण के लिए संदूषण के जोखिम को कम करने, लगातार उत्पाद की गुणवत्ता सुनिश्चित करने, श्रम और उत्पादन लागत को कम करने और प्रक्रिया विश्वसनीयता24,25 बढ़ाने के लिए बंद, मॉड्यूलर स्वचालन समाधान की आवश्यकता होती है। बहु-स्तरित फ्लास्क को बाँझ गैस विनिमय की सुविधा के लिए बंदरगाहों में से एक में बाँझ 0.2 μm फ़िल्टर होने से एक बंद प्रणाली के रूप में संभाला जा सकता है और एक दूसरा पोर्ट कनेक्टर या ट्यूब-वेल्डेड के माध्यम से सीधे सेल कटाई के लिए एक स्वचालित सेल प्रोसेसिंग उपकरण से जुड़ा होता है। हमने सेल, जीन या ऊतक-आधारित उत्पादों के निर्माण के लिए एक अभिनव बंद काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूज का मूल्यांकन करके डब्ल्यूजे-एचएमएससी पासिंग और कटाई के अधिकांश चरणों को बंद करने और स्वचालित करने की दिशा में काम किया। इस काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूज में विभिन्न प्रकार के सेल प्रोसेसिंग अनुप्रयोगों को करने की लचीलापन भी है, जैसे कि आकार के आधार पर सेल पृथक्करण, मध्यम / बफर एक्सचेंज, एकाग्रता, और विभिन्न प्रकार केसेल प्रकारों 8,26,27,28 के लिए कटाई। उपकरण एक बंद एकल-उपयोग किट का उपयोग करता है जिसे बैग स्थानांतरित करने के लिए ट्यूब वेल्डिंग या सड़न रोकनेवाला कनेक्टर का उपयोग करके बाँझ-जोड़ा जा सकता है या सीधे पसंद के किसी भी विस्तार मंच से जोड़ा जा सकता है।
इस अध्ययन में, हमने एकल-उपयोग काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन किट और बहु-स्तरित फ्लास्क के बीच बंद बाँझ कनेक्शन की अनुमति देने के लिए एक कस्टम ट्यूबिंग असेंबली तैयार की। हमने एक ही रन के भीतर पूरी तरह से बंद और अर्ध-स्वचालित तरीके से बहु-स्तरीय फ्लास्क से डब्ल्यूजे-एमएससी को एंजाइमेटिक रूप से अलग करने, धोने और कटाई करने के लिए एक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। कटाई किए गए डब्ल्यूजे-एचएमएससी को शुद्धता (सतह मार्कर विश्लेषण) और शक्ति (सीएफयू-एफ, ट्राइवंशीय भेदभाव और साइटोकिन स्राव प्रोफाइल) की विशेषता थी ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंतिम उत्पाद लॉट रिलीज के लिए महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (सीक्यूए) को पूरा करता है।
इस काम में, हमने एक काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन उपकरण का उपयोग करके एचएमएससी पृथक्करण को बंद करने और अर्ध-स्वचालित करने और बेंच पर धोने और फसल करने की क्षमता दिखाई है। पूरे वर्कफ़्लो में महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि टयूबिंग काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम प्रोटोकॉल बिल्डर में परिभाषित पूर्व निर्धारित प्रोटोकॉल के अनुसार जुड़े हुए हैं। सेटअप और ऑपरेशन सरल हैं, और किट असेंबली से सेल फसल तक 10-लेयर फ्लास्क से लगभग 2 एल कल्चर को संसाधित करने में लगभग 60 मिनट का समय लगा। इस वर्कफ़्लो में सीमित चरणों में से एक बहु-स्तरित फ्लास्क से काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन उपकरण से जुड़े ट्रांसफर बैग में द्रव हस्तांतरण है। उच्च-प्रवाह एकल-उपयोग किट को केवल 165 एमएल / मिनट की अधिकतम प्रवाह दर पर चलाया जा सकता है, और यह प्रसंस्करण के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, उदाहरण के लिए, 40-परत फ्लास्क। द्रव हस्तांतरण की प्रक्रिया को तेज करने के लिए, बाहरी उच्च-प्रवाह दर पंपों का उपयोग ट्रिप्सिनाइज्ड सामग्री को पहले एक ट्रांसफर बैग में स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है, इसके बाद काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके ट्रांसफर बैग से कोशिकाओं को धोने / ध्यान केंद्रित करने और कटाई करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को 4-परत से 10-परत बहु-स्तरित फ्लास्क तक पासिंग कोशिकाओं के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम को पिघले हुए एचएमएससी को धोने और बीज ट्रेन शुरू करने के लिए बहु-स्तरीय फ्लास्क में सीधी फसल और मध्यम सूत्रीकरण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन चैंबर में द्रवीकृत बिस्तर बनाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या लगभग 30 मिलियन कोशिकाएं हैं, और प्रति बैच प्रक्रिया के लिए अधिकतम अनुशंसित मात्रा 20 एल है।
वर्तमान में, जैव सुरक्षा कैबिनेट में बहु-स्तरीय फ्लास्क के लिए कस्टम ट्यूबिंग असेंबली का लगाव और घटकों के कुछ हिस्सों का ऑटोक्लेविंग सीजीएमपी सेटिंग में वांछनीय नहीं है। एक विकल्प के रूप में, एक कस्टम गामा-स्टरलाइज्ड टयूबिंग असेंबली को आपूर्तिकर्ताओं को आउटसोर्स किया जा सकता है। बहु-स्तरीय फ्लास्क प्रदान करने वाले आपूर्तिकर्ता वांछित टयूबिंग असेंबली के साथ फ्लास्क को पूर्व-फिट करने का विकल्प भी प्रदान करते हैं, जिसमें 0.2 μm फ़िल्टर और पूरे संगठन का गामा-नसबंदी शामिल है। यह सुनिश्चित करेगा कि बहुस्तरीय फ्लास्क और संलग्न टयूबिंग वास्तव में बंद हैं, जिसका अर्थ है कि प्रक्रिया को क्लास सी साफ कमरे की सेटिंग में बेंच पर पूरा किया जा सकता है।
काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करने वाली यह प्रक्रिया एक बहु-स्तरीय पोत में अनुयायी-आधारित सुसंस्कृत कोशिकाओं तक सीमित नहीं है और इसे गतिशील (हलचल-टैंक या तरंग बायोरिएक्टर) और स्थिर (गैस-पारगम्य) निलंबन-आधारित सेल विस्तार प्लेटफार्मों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से, 3 डी माइक्रोकैरियर संस्कृतियों में विस्तारित एचएमएससी के लिए, प्रोटोकॉल को माइक्रोकैरियर से अलग एचएमएससी को फसल, धोने और तैयार करने के लिए काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम पर अनुकूलित किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, बेहतर प्रक्रिया मजबूती और विश्वसनीयता के साथ ट्रांसलेशनल सेलुलर थेरेपी विकसित करने में बढ़ती रुचि ने बंद, स्वचालित सेल प्रोसेसिंग प्लेटफार्मों के विकास को जन्म दिया है। ये प्रणालियां अनिवार्य हैं, क्योंकि वे हैंडलिंग चरणों की संख्या को कम करते हैं, बाँझ कनेक्शन द्वारा संभावित संदूषण को रोकते हैं, और श्रम को कम करके और स्वच्छ कमरेकी जगह के प्रभावी उपयोग को बढ़ाकर विनिर्माण लागत को कम करते हैं। इसके अनुरूप, कई सेल थेरेपी उत्पाद डेवलपर्स जो अपने उपचारों का अनुवाद करने के लिए नियामक अनुमोदन की मांग कर रहे हैं, प्रक्रिया को बंद करने और प्रक्रिया विकास चरण14,31,32 के रूप में पूर्ण स्वचालन या अर्ध-स्वचालन को लागू करने के महत्व से अवगत हैं।
नियामक-अनुकूल एसएफएम एक्सएफ माध्यम के उपयोग के साथ, और 21 सीएफआर जीएमपी भाग 11 और अंतर्राष्ट्रीय गुणवत्ता दिशानिर्देशों के अनुरूप सहायक अभिकर्मकों के साथ, यह अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया नैदानिक विनिर्माण के लिए आसानी से उपयुक्त होगी। हमने बंद प्रक्रिया की प्रजनन क्षमता और डब्ल्यूजे-एमएससी की गुणवत्ता के रखरखाव को दिखाया है। बहु-स्तरीय फ्लास्क में अनुयायी-आधारित कोशिकाओं के संवर्धन की दक्षता और सुरक्षा में सुधार से न केवल एचएमएससी थेरेपी क्षेत्र को बल्कि सेल लाइन बैंकिंग और अनुयायी वायरस उत्पादन में कंपनियों को भी लाभ होगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक ए*स्टार, सिंगापुर से इंडस्ट्री अलाइनमेंट फंड प्री-पोजिशनिंग (आईएएफ-पीपी) फंडिंग (एच18/01/ए0/021 और एच18/एएच/ए0/001) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |