Här presenterar vi ett protokoll för att skörda vidhäftande celler från flerskiktskolvar på ett slutet halvautomatiserat sätt med hjälp av ett motströmscentrifugeringssystem. Detta protokoll kan tillämpas för att skörda både vidhäftande celler och suspensionsceller från andra cellexpansionsplattformar med få modifieringar av de befintliga stegen.
Humana mesenkymala stamceller (hMSC) undersöks för närvarande som en lovande cellbaserad terapeutisk modalitet för olika sjukdomar, med fler marknadsgodkännanden för klinisk användning som förväntas under de närmaste åren. För att underlätta denna övergång är det viktigt att ta itu med flaskhalsarna i skala, lot-to-lot-reproducerbarhet, kostnad, regelefterlevnad och kvalitetskontroll. Dessa utmaningar kan hanteras genom att stänga processen och anta automatiserade tillverkningsplattformar. I denna studie utvecklade vi en sluten och halvautomatisk process för att passera och skörda Whartons gelé (WJ) -härledda hMSC (WJ-hMSC) från flerskiktiga kolvar med användning av motströmscentrifugering. WJ-hMSC utvidgades med hjälp av regulatoriskt kompatibelt serumfritt xenofritt (SFM XF) medium, och de visade jämförbar cellproliferation (populationsfördubbling) och morfologi med WJ-hMSC expanderade i klassiska seruminnehållande medier. Vårt slutna halvautomatiska skördeprotokoll visade hög cellåtervinning (~ 98%) och livskraft (~ 99%). Cellerna tvättades och koncentrerades med motströmscentrifugering bibehöll WJ-hMSC ytmarköruttryck, kolonibildande enheter (CFU-F), trilineagedifferentieringspotential och cytokinsekretionsprofiler. Det halvautomatiska cellskördeprotokollet som utvecklats i studien kan enkelt tillämpas för liten till medelstor bearbetning av olika vidhäftande celler och suspensionsceller genom att direkt ansluta till olika cellexpansionsplattformar för att utföra volymminskning, tvättning och skörd med låg produktionsvolym.
Humana mesenkymala stamceller (hMSC) är en utmärkt kandidat för kliniska tillämpningar, både inom vävnadsteknik och cellterapier, med tanke på deras terapeutiska potential och höga självförnyelsepotential att växa in vitro, vilket är avgörande för att generera kliniskt relevanta doser av celler 1,2,3. Enligt ClinicalTrials.gov finns det över 1,000 kliniska prövningar som för närvarande undersöks för olika sjukdomstillstånd4. Mot bakgrund av det ökande intresset för att använda hMSC är fler kliniska prövningar och marknadsgodkännanden nära förestående inom en snar framtid 5,6. Tillverkningen av hMSC har dock många inneboende utmaningar när det gäller batch-till-batch-variabilitet, användningen av högriskråvaror, oro för kontaminering på grund av många öppna och manuella processer, eftersom tillverkningen innebär flera enhetsoperationer, högre arbetskraftskostnader, kostnaden för att skala ut eller skala upp och regulatoriska hinder 6,7,8,9,10, 11,12. Dessa frågor utgör fortfarande ett betydande hinder för nuvarande och framtida marknadstillträde.
Utvecklingen av slutna, modulära, automatiserade tillverkningslösningar och användning av lågriskreagens skulle lösa dessa utmaningar. Detta skulle också säkerställa konsekvent produktkvalitet, minska sannolikheten för batchfel på grund av mänskliga fel, minska arbetskraftskostnaderna och förbättra processstandardisering och regelefterlevnad, till exempel när det gäller digital batchregistrering 8,12,13,14. För att kunna erhålla en kliniskt relevant dosering av celler, vare sig det är autolog eller allogen, är strömlinjeformad tillverkning som involverar uppströms cellexpansion och nedströms bearbetning på ett slutet, automatiserat sätt avgörande.
För uppströms hMSC-expansion är de två vanligaste tillverkningsmetoderna som för närvarande används utskalning (2D-monolager) och uppskalning (3D-mikrobärarbaserat upphängningssystem)15,16,17,18. Den mest traditionella och allmänt använda metoden för hMSC-expansion är 2D-monolagerbaserad kultur på grund av den låga produktionskostnaden och enkel installation19.
Flerskiktskolvar bestående av plana ytbrickor staplade i ett odlingskärl används vanligtvis för att skala ut hMSC-produktionen. Dessa system kommer vanligtvis i 1-lager till 40-lagers odlingskärl20 och hanteras manuellt inuti biosäkerhetsskåp. Bearbetningsstegen under cellpassage och skörd innefattar manuell dosering och dekantering av expansionsmediet, dissociationsreagens och tvättbuffert genom pipettering eller fysisk lutning av hela kärlet. Dessutom är hantering av flera enheter utmanande och tidskrävande på grund av deras stora storlek och vikt.
Därefter är efterskörd från flerskiktskolvar, centrifugering för medieutbyte, celltvätt och volymminskning viktiga steg i hela arbetsflödet för celltillverkning21. Konventionell bänkcentrifugering är en mestadels öppen och manuell process som involverar en mängd steg, såsom överföring av cellsuspensionen till täckta rör eller flaskor inuti ett biosäkerhetsskåp, snurrar ner cellerna, manuellt aspirerar supernatanten, cellresuspension med bufferten och upprepade celltvättar. Detta ökar dramatiskt både risken för kontaminering på grund av öppning och stängning av locken och risken att förlora cellpelleten under den manuella aspirations-/pipetteringprocessen22. I samband med hantering av flerskiktade odlingssystem för vidhäftande baserade celler som hMSC, skulle operatören behöva gå igenom en mödosam process med skytteltrafik mellan centrifugen och biosäkerhetsskåpet upprepade gånger och hantera en tung enhet samtidigt. Dessa manuella steg är mödosamma, medför risker i form av mänskliga fel och kontaminering och måste utföras i en renrumsmiljö av klass B, vilket är kostsamt23. Dessutom är den konventionella manuella centrifugeringsprocessen inte skalbar och kan orsaka cellulär skjuvning och spänning; Således är maximering av cellåtervinning, livskraft och tvätteffektivitet av kvarvarande föroreningar andra stora utmaningar22. Kommersiell cGMP-skaltillverkning av cellterapier kräver slutna, modulära automatiseringslösningar för att minska risken för kontaminering, säkerställa konsekvent produktkvalitet, minska arbets- och produktionskostnader och öka processäkerheten24,25. Flerskiktskolvar kan hanteras som ett slutet system genom att ha ett sterilt 0,2 μm-filter i en av portarna för att underlätta sterilt gasutbyte och en andra port aseptiskt ansluten via kontakter eller rörsvetsad direkt till ett automatiserat cellbearbetningsinstrument för cellskörd. Vi arbetade för att stänga och automatisera de flesta stegen i WJ-hMSC-passering och skörd genom att utvärdera en innovativ sluten motströmscentrifug avsedd för tillverkning av cell-, gen- eller vävnadsbaserade produkter. Denna motströmscentrifug har också flexibiliteten att utföra en mängd olika cellbehandlingsapplikationer, såsom cellseparation baserat på storlek, medium / buffertbyte, koncentration och skörd för en mängd olika celltyper 8,26,27,28. Instrumentet använder en sluten engångssats som kan anslutas sterilt med rörsvetsning eller aseptiska kontakter för att överföra påsar eller kan anslutas direkt till valfri expansionsplattform.
I denna studie konstruerade vi en anpassad slangenhet för att möjliggöra slutna sterila anslutningar mellan engångscentrifugeringssatsen för motflöde och flerskiktskolven. Vi optimerade ett protokoll för att enzymatiskt lossa, tvätta och skörda WJ-MSC från flerskiktskolven på ett helt slutet och halvautomatiserat sätt inom en enda körning. De skördade WJ-hMSC: erna karakteriserades för renhet (ytmarköranalys) och styrka (CFU-F, trilineagedifferentiering och cytokinsekretionsprofiler) för att säkerställa att slutprodukten uppfyllde de kritiska kvalitetsattributen (CQA) för partifrisättning.
I detta arbete har vi visat förmågan att stänga och halvautomatisera hMSC-dissociation och tvätta och skörda på bänken med hjälp av ett motströmscentrifugeringsinstrument. Ett av de kritiska stegen i hela arbetsflödet är att se till att slangarna är anslutna enligt det förinställda protokollet som definierats i protokollbyggaren för motflödescentrifugeringssystemet. Installationen och driften är enkel, och den tid det tog att bearbeta cirka 2 liter kultur från en 10-lagers kolv från kitmontering till cellskörd var cirka 60 minuter. Ett av de begränsande stegen i detta arbetsflöde är vätskeöverföringen från flerskiktskolven till överföringspåsarna anslutna till motströmscentrifugeringsinstrumentet. Högflödessatsen för engångsbruk kan endast köras med en maximal flödeshastighet på 165 ml/min, och detta kan vara utmanande för bearbetning, till exempel en 40-lagers kolv. För att påskynda processen för vätskeöverföring kan externa högflödespumpar användas för att överföra det trypsiniserade innehållet till en överföringspåse först, följt av tvättning / koncentration och skörd av cellerna från överföringspåsen med hjälp av motströmscentrifugeringssystemet. Dessutom kan detta protokoll också tillämpas för att passera celler från 4-lager till 10-lagers flerskiktiga kolvar. Längre uppströms kan motströmscentrifugeringssystemet också optimeras för tvättning av tinade hMSC och direkt skörd och mediumformulering i flerskiktskolvar för att starta såtåget. Det bör noteras att det minsta antalet celler som krävs för att bilda den fluidiserade bädden i motströmscentrifugeringskammaren är cirka 30 miljoner celler och den maximala rekommenderade volymen att bearbeta per sats är 20 liter.
För närvarande är det inte önskvärt att fästa den anpassade slangenheten på flerskiktskolven i biosäkerhetsskåpet och autoklaveringen av komponenternas delar i en cGMP-inställning. Som ett alternativ kan en anpassad gammasteriliserad slangenhet outsourcas till leverantörer. Leverantörer som tillhandahåller flerskiktskolvar erbjuder också möjligheten att förmontera kolvarna med önskade slangaggregat, inklusive ett 0,2 μm filter och gammasterilisering av hela utrustningen. Detta skulle säkerställa att flerskiktskolvarna och tillhörande slangar verkligen är stängda, vilket innebär att processen kan slutföras på bänken i en klass C-renrumsinställning.
Denna process som använder motströmscentrifugeringssystemet är inte begränsad till vidhäftningsbaserade odlade celler i ett flerskiktat kärl och kan anpassas till dynamiska (omrörda tank eller vågbioreaktorer) och statiska (gasgenomsläppliga) suspensionsbaserade cellexpansionsplattformar. Specifikt, för hMSC expanderade i 3D-mikrobärarkulturer, kan protokoll optimeras på motströmscentrifugeringssystemet för att skörda, tvätta och formulera hMSC: erna dissocierade från mikrobärare.
Sammantaget har det ökande intresset för att utveckla translationella cellulära terapier med förbättrad processrobusthet och tillförlitlighet lett till utvecklingen av slutna, automatiserade cellbehandlingsplattformar. Dessa system är absolut nödvändiga, eftersom de minskar antalet hanteringssteg, förhindrar potentiell kontaminering genom sterila anslutningar och minskar tillverkningskostnaderna genom att minska arbetskraften och förbättra den effektiva användningen av renrumsutrymme21. I linje med detta är många av de cellterapiproduktutvecklare som söker regulatoriskt godkännande för att översätta sina terapier medvetna om vikten av att stänga processen och implementera full automatisering eller halvautomatisering redan i processutvecklingsstadiet 14,31,32.
Med användning av regleringsvänligt SFM XF-medium, och tillsammans med tillhörande reagens som överensstämmer med 21 CFR GMP Part 11 och internationella kvalitetsriktlinjer, skulle denna halvautomatiserade process vara lätt lämplig för klinisk tillverkning. Vi har visat reproducerbarheten av den slutna processen och upprätthållandet av kvaliteten på WJ-MSC. Att förbättra effektiviteten och säkerheten vid odling av vidhäftningsbaserade celler i flerskiktskolvar skulle gynna inte bara hMSC-terapifältet utan även företag inom cellinjebank och vidhäftande virusproduktion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för stöd från finansieringen från Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 och H18/AH/a0/001) från A*STAR, Singapore.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |