פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. הפרוטוקול מספק סימוכין לאופטימיזציה של מצב היישום הטוב ביותר של הרפואה הסינית המסורתית (TCM).
לאור יתרונות השילוב של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בטיפול באיסכמיה מוחית, חקרנו את ההבדלים ביעילות ובמנגנון בין שילוב התכשיר לשילוב הרכיבים על מנת לבחון את אסטרטגיית שילוב שני צמחי המרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. קובלט כלוריד (CoCl2) בשילוב עם מדיום נטול גלוקוז שימש כדי לגרום נזק חמצוני של תאי PC12. לאחר מכן, השילוב האופטימלי של הזרקת Astragalus mongholicus (Ast) והזרקת Erigeron breviscapus (Eri) נבחר ושולב בשיטות עיצוב אחידות לאחר סינון הריכוז הבטוח והיעיל שלהם על תאי PC12. יתר על כן, שילוב הרכיבים שנבדק כולל 10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין, ו 75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית בשני עשבי תיבול. לאחר מכן, MTT, Annexin V-FITC/PI, immunofluorescence, וניתוח כתמים מערביים שימשו להערכת היעילות והמנגנון של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים על תאי PC12 פגועים. התוצאות הראו כי שילוב ההכנה האופטימלי להישרדות תאים היה הזרקת Ast וקפסולה Eri עם ריכוז של 6:1.8 (μM). שילוב הרכיבים (10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין ו-75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית) היה יעיל יותר משילוב ההכנה. שני הצירופים הפחיתו במידה ניכרת את קצב האפופטוטי, את עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 ואת רמת החמצן הריאקטיבי התוך-תאי (ROS); בינתיים, הם שיפרו את רמות הביטוי של p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax ו-Nrf2. השפעות אלה ניכרו יותר בשילוב הרכיבים. לסיכום, שני השילובים יכולים לעכב את הפגיעה הנגרמת על ידי CoCl2 בשילוב עם תווך ללא גלוקוז על תאי PC12, ובכך לקדם את הישרדות התא. עם זאת, היעילות של שילוב הרכיבים על פני שילוב ההכנה עשויה לנבוע מהוויסות החזק יותר של מסלול האיתות PI3K/Akt/Nrf2 הקשור לעקה חמצונית ואפופטוזיס.
איסכמיה מוחית כרונית, הנגרמת על ידי היפופרפוזיה מוחית, היא מחלה שכיחה בקרב אנשים בגיל העמידה וקשישים1. כמחלת איסכמיה סמויה ארוכת טווח, היא עלולה להוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך. המנגנונים הפתולוגיים העיקריים כוללים אפופטוזיס של תאים ונזק חמצוני, המוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך; זהו הבסיס הפתולוגי של מחלת אלצהיימר, דמנציה וסקולרית ומחלות אחרות, ומשפיע קשות על איכות החיים של החולים. עם זאת, עדיין חסרות תרופות אידיאליות ברפואה המודרנית לטיפול באיסכמיה מוחית כרונית2. במקביל, השילוב של Astragalus mongholicus (Ast) ו- Erigeron breviscapus (Eri) נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית (TCM)4. האסטרטגיה המשולבת השתפרה להפליא בקידום התאוששות תפקוד העצבים לאחר איסכמיה מוחית, שהיא טובה יותר מזו של תרופה בודדת; עם זאת, ישנם הבדלים גדולים ביחס המינון בשילוב של שתי התרופות4. המרכיבים היעילים ומנגנון הפעולה אינם מוגדרים היטב, וזהו נושא המפתח המגביל את היישום הקליני שלה.
מחקרים קודמים הדגימו את ההשפעה הסינרגיסטית של שילוב ההכנה של הזרקת Ast והזרקת Eri בטיפול באיסכמיה מוחית בחולדות. זה יכול לווסת את הביטוי של חלבון p-Akt ולהפחית את הביטוי של Bcl-2 הקשורים למוות מקדמי מוות (BAD) חלבון5,6, שהוא אחד ממשפחת B-לימפובלסטומה 2 (Bcl-2) חלבונים ויש לו השפעה של קידום אפופטוזיס. עם זאת, הבסיס החומרי והמנגנון של השפעתה הסינרגטית אינם ברורים. יתר על כן, מודל הפציעה של תאי PC12 הוקם עם CoCl2 משולב תווך ללא גלוקוז, ושילוב הרכיבים האופטימלי ב- Ast ו- Eri נבדק והוגדר7.
במחקר זה, המינונים היעילים של Ast ו- Eri נבדקים באמצעות מודל תאי PC12 הפגוע. השילוב האופטימלי של שתי התרופות נבדק באמצעות מודל זה בשילוב עם שיטת התכנון ההומוגנית. מודל התא משמש להערכה נוספת של ההבדל בהשפעות ובמנגנונים של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים בתאי PC12 פגועים. אסטרטגיה זו שואפת לחקור את אפקט ההגנה ואת מנגנון הבקרה של שני סוגי הצירופים על תאי PC12 פגועים באמצעות מסלול האות PI3K/Akt/Nrf2 כדי לקבוע את מצב השילוב הטוב ביותר. מחקר זה מספק התייחסות למיטוב מצב היישום הטוב ביותר של TCM.
עדיין חסרות תרופות אידיאליות לטיפול באיסכמיה מוחית בפרקטיקה הקלינית המודרנית2. בהנחיית תוספת צ’י והפעלת שיטת זרימת הדם, אסט, ארי ותכשירים אחרים שימשו בשילוב בפרקטיקה הקלינית של TCM והשיגו יתרונות מקיפים טובים13,14,15. מספר רב של ?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי פרויקטי מו”פ מרכזיים של המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז סצ’ואן (2020YFS0325).
1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |