Explorando a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas
Summary
Este protocolo fornece uma estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O protocolo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação da medicina tradicional chinesa (MTC).
Abstract
Tendo em vista as vantagens da combinação da medicina tradicional chinesa (MTC) no tratamento da isquemia cerebral, estudamos as diferenças na eficácia e no mecanismo entre a combinação de preparação e a combinação de componentes, a fim de explorar a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O cloreto de cobalto (CoCl2) combinado com um meio livre de glicose foi empregado para induzir danos oxidativos das células PC12. Em seguida, a combinação ideal de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) foi selecionada e combinada seguindo métodos de design uniformes após a triagem de sua concentração segura e eficaz em células PC12. Além disso, a combinação de componentes rastreados compreende 10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico em duas ervas. Em seguida, MTT, anexina V-FITC/PI, imunofluorescência e Western blot foram utilizados para avaliar a eficácia e o mecanismo da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Os resultados mostraram que a combinação de preparação ideal para a pró-sobrevivência celular foi a injeção de Ast e a cápsula de Eri com uma concentração de 6:1,8 (μM). A combinação de componentes (10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico) foi mais eficaz do que a combinação de preparação. Ambas as combinações reduziram notavelmente a taxa apoptótica, a intensidade de fluorescência da caspase-3 e o nível de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular; enquanto isso, eles regularam positivamente os níveis de expressão de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax e Nrf2. Esses efeitos foram mais evidentes na combinação de componentes. Em conclusão, ambas as combinações podem inibir a lesão induzida pela CoCl2 combinada com um meio livre de glicose nas células PC12, promovendo assim a sobrevivência celular. No entanto, a eficiência da combinação de componentes sobre a combinação de preparação pode ser devida à sua regulação mais forte da via de sinalização PI3K/Akt/Nrf2 relacionada ao estresse oxidativo e à apoptose.
Introduction
A isquemia cerebral crônica, causada por hipoperfusão cerebral, é uma doença comum em pessoas de meia-idade e idosos1. Como uma doença de isquemia oculta a longo prazo, pode levar a disfunção neurológica progressiva ou persistente. Os principais mecanismos patológicos incluem apoptose celular e dano oxidativo, levando a disfunção neurológica progressiva ou persistente; esta é a base patológica da doença de Alzheimer, demência vascular e outras doenças, e afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, ainda há uma falta de drogas ideais na medicina moderna para tratar a isquemia cerebral crônica2. Ao mesmo tempo, a combinação de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) tem sido amplamente utilizada na prática clínica da medicina tradicional chinesa (MTC)4. A estratégia de combinação melhorou notavelmente na promoção da recuperação da função nervosa após isquemia cerebral, que é melhor do que a de uma única droga; no entanto, existem grandes diferenças na razão de dosagem na combinação das duas drogas4. Os componentes efetivos e o mecanismo de ação não estão bem definidos, o que é a questão-chave que restringe sua aplicação clínica.
Estudos anteriores demonstraram o efeito sinérgico da combinação de preparação da injeção de Ast e da injeção de Eri no tratamento da isquemia cerebral em ratos. Pode regular positivamente a expressão da proteína p-Akt e regular negativamente a expressão da proteína promotora de morte associada (TAB)Bcl-2 5,6, que é uma das proteínas da família do linfoblastoma B 2 (Bcl-2) e tem o efeito de promover a apoptose. No entanto, a base material e o mecanismo de seu efeito sinérgico não são claros. Além disso, o modelo de lesão de células PC12 foi estabelecido com o meio combinado livre de glicose CoCl2, e a combinação ótima de componentes em Ast e Eri foi rastreada e definida7.
Neste estudo, as doses efetivas de Ast e Eri são rastreadas usando o modelo de célula PC12 lesionado. A combinação ideal das duas drogas é rastreada usando este modelo combinado com o método de design homogêneo. O modelo celular é usado para avaliar melhor a diferença nos efeitos e mecanismos da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Esta estratégia visa explorar o efeito protetor e o mecanismo regulador dos dois tipos de combinações em células PC12 lesadas através da via de sinal PI3K/Akt/Nrf2 para determinar o melhor modo de combinação. Este estudo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação do TCM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ainda há carência de medicamentos ideais para o tratamento da isquemia cerebral na prática clínica moderna2. Sob a orientação da suplementação de qi e ativação do método de circulação sanguínea, Ast, Eri e outras preparações têm sido utilizadas em combinação na prática clínica da MTC e têm alcançado boas vantagens abrangentes13,14,15. Um grande número de estudos tem demonstrado que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada por projetos-chave de P & D do Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020YFS0325).
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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