Drosophila melanogaster의 내인성 유전자 태깅을 위한 원스텝 CRISPR 기반 전략

요약

여기에서는 성공적인 유전자 변형의 마커 없는 식별을 위해 PCR 기반 기술을 활용하여 안정적인 knock-in 라인의 개발을 촉진하는 초파리에 대한 단순화된 내인성 유전자 태깅 프로토콜을 제시합니다.

초록

살아있는 세포에 있는 단백질 subcellular 국소화, 동역학 및 규칙에 대한 학문은 형광 융합 단백질을 생성하기 위하여 내인성 유전자의 표를 붙이는 것을 허용하는 기술의 출현에 의해 근본적으로 변형되었습니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 단백질 거동을 실시간으로 시각화하여 세포 환경 내에서 단백질의 기능과 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 많은 유전자 태그 연구는 첫 번째 단계에서 눈 색깔 변화와 같은 가시 마커를 사용하여 유전자 변형 유기체를 식별하고 두 번째 단계에서 가시 마커를 제거하는 2단계 프로세스를 사용합니다. 여기에서는 눈에 보이는 아이 마커 없이 조작된 라인을 스크리닝할 수 있는 Drosophila melanogaster에서 정확하고 신속한 내인성 유전자 태깅을 수행하기 위한 원스텝 프로토콜을 제시하여 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 성공적인 유전자 태그 부착 이벤트를 스크리닝하기 위해 PCR 기반 기술을 사용하여 중간 다리의 작은 부분을 분석하여 개별 파리의 유전자형을 분석합니다. 스크리닝 기준을 통과한 파리는 안정적인 주식을 생산하는 데 사용됩니다. 여기에서는 CRISPR 편집 플라스미드의 설계 및 구성과 엔지니어링 라인의 스크리닝 및 확인 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 Drosophila 에서 내인성 유전자 태깅의 효율성을 크게 향상시키고 생체 내 세포 과정 연구를 가능하게 합니다.

서론

형광 단백질은 살아있는 유기체 내 세포의 단백질 국소화, 역학 및 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다 ^1,2. 형광 단백질로 내인성 유전자를 태깅하면 세포 내 분해능으로 세포 과정의 장기 라이브 이미징이 가능합니다. 또한, 이러한 내인성 유전자 표지 기술은 과발현 및 면역염색 접근법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 단백질의 과발현은 단백질 잘못 접힘, 비특이적 단백질-단백질 상호작용 및 잘못된 국소화를 유발할 수 있다³. 현재까지 연구자들은 효율적인 상동 재조합을 겪을 수 있는 신진 효모와 같은 몇 가지 모델 유기체를 위해 형광 단백질에 융합된 내인성 유전자의 방대한 라이브러리를 만들 수 있었다⁴. Drosophila melanogaster의 경우, 유전자를 형광 태깅하기 위해 MiMICs⁵, transposon 기반 enhancer traps⁶ 및 fosmids⁷과 같은 다양한 도구가 고안되었습니다.

프로토콜

1. 유전자 편집 시약의 설계 및 구축

참고: 내인성 태깅을 수행하려면 원하는 유전자의 다양한 동형을 식별하는 것이 필수적입니다. 실험의 특정 목표에 따라 형광 태그를 내부적으로 또는 선택한 단백질 동형의 N- 또는 C-말단에 통합할 수 있습니다. 최적의 CRISPR 매개 편집을 위해서는 두 개의 sgRNA를 의도한 knock-in 부위에 적절하게 가깝게 배치하는 것이 중요합니다. 그 후, 상동 재조합을 통한 편집을 가능하게 하기 위해, 형광 태그와 함께 표적 유전자와 상동성 서열을 포함하는 donor 벡터를 준비해야 합니다. 다음은 이러한 프로세스에 대한 단계별 가이드입니다(그림 1).

1. 아래에 설명된 대로 sgRNA를 설계합니다.
   1. http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ 또는 http://www.flyrnai.org/crispr2/ 웹사이트를 사용하여 초파리 에 대한 sgRNA를 설계합니다.
   2. flycrispr 웹 사이트의 경우 원하는 knock-in 위치(N 말단, C 말단 또는 관심 게놈 자리)를 둘러싼 서열 ±100bp를 입력합니다. nos-Cas9 attP2를 주입....

결과

우리의 실험에서, 우리는 일반적으로 모든 염색체 (X, II, III)에서 다양한 내인성 태그 유전자 스크리닝에서 ~ 20 % -30 %의 성공률을 발견했습니다. 이 공정의 효율성은 gRNA 선택, 유전자의 특성 및 주입 품질과 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에서는 내인성 기간 유전자에 mNeonGreen 형광단¹³을 태그하는 전략의 결과를 설명합니다. D. melanogaster의 X 염색체에 위치한 생리 유전자는 생체 시계에서 중추적인 역할을 합니다. 초파리(Drosophila)는 시계 단백질(clock protein)을 발현하는 약 150개의 시계 뉴런(clock neuron)으로 구성된 잘 특성화된 시계 네트워크(clock network)를 가지고^{있다 17}.

토론

이 결과는 초파리의 내인성 유전자를 태깅하기 위한 간소화되고 간단한 CRISPR 기반 전략을 보여줍니다. 프로토콜에서는 두 개의 gRNA를 사용하여 DNA 이중 가닥 절단과 상동 재조합을 보다 효율적으로 유도합니다. gRNA와 donor plasmid는 생식세포에서 Cas9 효소를 발현하는 초파리 배아에 주입됩니다. 이 배아는 이후 성체가 될 때까지 표준 조건에서 배양되며, 성인이 되면 밸런서파리와 교배되어 1세대(F1) 자손을 낳습니다. PCR 유전형 분석은 유전자 변형 파리를 선별하기 위해 각 F1 검체의 중간 다리에서 수행됩니다. 이 방법은 스크리닝의 2단계를 사용하는 현재의 스크리닝 방법에 비해 상당한 이점을 제공하는데, 여기서 첫 번째 단계는 적절한 유전자형을 식별하기 위해 눈 색깔과 같은 가시적인 마커를 사용하는 것에 의존하고 두 번째 단계는 눈 색깔 마커(¹⁰)의 제거를 포함한다. 여기에서는 개별 파리의 중간 다리의 작은 부분에서 추출한 DNA에 PCR을 사.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha 유능 E. 대장균 ( 고효율)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
염산	Fisher Scientific	A142-212
연장 유리 퇴색 방지 장착 매체	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
염화	나트륨피셔 사이언티픽	S271-500
T4 DNA 리가제	NEB	M0202S
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S