Niet-invasieve echografie van endometriumkankerprogressie bij Pax8-gerichte deletie van de tumoronderdrukkers Arid1a en Pten bij muizen
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren van de progressie van morfologische veranderingen in de loop van de tijd in de baarmoeder in een induceerbaar muismodel van endometriumkanker met behulp van echografie met correlatie met grove en histologische veranderingen.
Abstract
Baarmoederkanker kan worden bestudeerd bij muizen vanwege het gemak van hantering en genetische manipulatie in deze modellen. Deze studies zijn echter vaak beperkt tot het beoordelen van pathologie post-mortem bij dieren die op meerdere tijdstippen in verschillende cohorten zijn geëuthanaseerd, waardoor het aantal muizen dat nodig is voor een studie toeneemt. Beeldvormende muizen in longitudinale studies kunnen de progressie van de ziekte bij individuele dieren volgen, waardoor het aantal benodigde muizen wordt verminderd. Vooruitgang in ultrasone technologie heeft de detectie van veranderingen op micrometerniveau in weefsels mogelijk gemaakt. Echografie is gebruikt om follikelrijping in eierstokken en xenograftgroei te bestuderen, maar is niet toegepast op morfologische veranderingen in de baarmoeder van de muis. Dit protocol onderzoekt de juxtapositie van pathologie met in vivo beeldvormingsvergelijkingen in een geïnduceerd endometriumkankermuismodel. De kenmerken waargenomen door echografie waren consistent met de mate van verandering waargenomen door grove pathologie en histologie. Echografie bleek zeer voorspellend te zijn voor de waargenomen pathologie en ondersteunde de opname van echografie in longitudinale studies van baarmoederziekten zoals kanker bij muizen.
Introduction
Muizen blijven een van de belangrijkste diermodellen voor voortplantingsstoornissen 1,2,3. Er zijn verschillende genetisch gemodificeerde of geïnduceerde knaagdiermodellen van eierstok- en baarmoederkanker. Deze studies zijn meestal afhankelijk van meerdere cohorten die op verschillende tijdstippen worden geëuthanaseerd om longitudinale trends in morfologische en pathologische veranderingen vast te leggen. Dit voorkomt de mogelijkheid om continue gegevens over de ontwikkeling van kanker in een individuele muis te verkrijgen. Bovendien, zonder de individuele ziekteprogressietoestand van de muis te kennen, zijn interventiestudies gebaseerd op vooraf bepaalde tijdstippen en gemiddelde bevindingen van eerdere cohorten in plaats van individuele drempels voor de detectie van progressie bij een specifiek dier 4,5. Daarom zijn beeldvormingsbenaderingen nodig die longitudinale beoordeling bij levende dieren mogelijk maken om preklinische modellen voor het testen van nieuwe geneesmiddelen of verbindingen te vergemakkelijken en het begrip van pathobiologie te versnellen en tegelijkertijd de striktheid en reproduceerbaarheid te vergroten6.
Echografie (VS) is een aantrekkelijke methode voor de longitudinale monitoring van de progressie van baarmoederkanker bij muizen omdat het relatief gemakkelijk en goedkoop is in vergelijking met andere beeldvormingsmethoden, gemakkelijk uit te voeren is en een opmerkelijke resolutie 6,7 kan hebben. Deze niet-invasieve modaliteit kan kenmerken op micronschaal vastleggen bij wakkere muizen of bij muizen onder korte sedatie met behulp van een examen van 5-10 minuten. Ultrasone microscopie is gevalideerd als een methode om de ontwikkeling van de ovariële follikel bij muizen te meten 8 en de groei van geïmplanteerde of geïnduceerde neoplasie 9,10,11. Hoogfrequente US is ook gebruikt voor percutane intra-uteriene injecties12 en het observeren van de baarmoederverandering van ratten gedurende de oestruscyclus13. Hoogfrequente US kan worden gebruikt met muizen die op gespecialiseerde stationaire platforms worden gehouden met behulp van een railsysteem om de transducer / sonde vast te houden om beelden met een hoge resolutie vast te leggen met gestandaardiseerde positie en druk; Deze apparatuur is echter niet bij alle instellingen beschikbaar. Hand-held transducer scanmethoden kunnen worden toegepast met minder speciale apparatuur en worden gebruikt voor zowel klinische diagnostiek als onderzoekstoepassingen bij muizen.
De vraag blijft of Amerikaanse beeldvorming met handbediende, hoogfrequente sondes kan worden gebruikt om de ontwikkeling van baarmoederkanker gedurende meerdere weken te volgen. Net als de darmen is de baarmoeder van knaagdieren een dunwandige, slanke structuur die zeer mobiel is in de buik en aaneengesloten is door meerdere weefseldiepten, waardoor beeldvorming uitdagender is dan bij relatief onbeweeglijke organen zoals de nieren. Deze studie probeerde de correlatie vast te stellen tussen weefsels waargenomen door echografie en histopathologie, oriëntatiepunten te definiëren voor het lokaliseren van de baarmoeder van de muis en de haalbaarheid van de longitudinale beoordeling van endometriumkanker te bepalen. Deze studie presenteert gegevens die een kwalitatieve overeenkomst laten zien tussen het uiterlijk van uteri in beeld gebracht door de VS en histopathologie, evenals seriële beeldvorming van muizen gedurende meerdere weken. Deze resultaten geven aan dat hand-held US kan worden gebruikt om de ontwikkeling van endometriumkanker bij muizen te volgen, waardoor een mogelijkheid ontstaat voor het verzamelen van individuele longitudinale gegevens van muizen om baarmoederkanker te bestuderen zonder de noodzaak van speciale apparatuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol onderzoekt het nut van echografie voor het beoordelen van baarmoedermorfologische veranderingen in de progressie van adenocarcinoom in de baarmoeder bij muizen. In deze studie, door de inductie van endometriumkanker bij muizen longitudinaal te volgen, bleken de anatomische details gedetecteerd door echografie indicatoren te zijn van grove en histologische pathologie. Dit opent de deur voor het gebruik van longitudinale studies met kleinere aantallen muizen die op meerdere tijdstippen door echografie worden g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de financiering van het NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, postdoctoraal trainingsprogramma 5T32OD011089 en de Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Het project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door de subsidies voor lopende uitgaven aan particuliere instellingen voor hoger onderwijs van de Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
