Avaliação Ultrassonográfica Não Invasiva da Progressão do Câncer de Endométrio na Deleção Dirigida por Pax8 dos Supressores Tumorais Arid1a e Pten em Camundongos
Summary
Este protocolo descreve um método para monitorar a progressão das alterações morfológicas ao longo do tempo no útero em um modelo induzível de câncer de endométrio em camundongos usando imagens ultrassonográficas com correlação com alterações macroscópicas e histológicas.
Abstract
Os cânceres uterinos podem ser estudados em camundongos devido à facilidade de manuseio e manipulação genética nesses modelos. No entanto, esses estudos são frequentemente limitados a avaliar patologia post-mortem em animais eutanasiados em vários momentos em diferentes coortes, o que aumenta o número de camundongos necessários para um estudo. Imagens de camundongos em estudos longitudinais podem rastrear a progressão da doença em animais individuais, reduzindo o número de camundongos necessários. Os avanços na tecnologia de ultrassom têm permitido a detecção de alterações no nível micrométrico dos tecidos. A ultrassonografia tem sido usada para estudar a maturação dos folículos nos ovários e o crescimento do xenoenxerto, mas não tem sido aplicada às alterações morfológicas no útero de camundongos. Este protocolo examina a justaposição de patologia com comparações de imagens in vivo em um modelo de camundongo com câncer de endométrio induzido. As características observadas pela ultrassonografia foram consistentes com o grau de alteração observado pela patologia macroscópica e histologia. A ultrassonografia mostrou-se altamente preditiva da patologia observada, apoiando a incorporação da ultrassonografia em estudos longitudinais de doenças uterinas, como câncer em camundongos.
Introduction
Camundongos continuam sendo um dos modelos animais mais importantes para distúrbios reprodutivos 1,2,3. Existem vários modelos de roedores geneticamente modificados ou induzidos de câncer de ovário e útero. Esses estudos tipicamente se baseiam em múltiplas coortes eutanasiadas em diferentes momentos para capturar tendências longitudinais em alterações morfológicas e patológicas. Isso impede a capacidade de adquirir dados contínuos sobre o desenvolvimento do câncer em um camundongo individual. Além disso, sem conhecer o estado de progressão da doença individual em camundongos, os estudos de intervenção são baseados em pontos de tempo predeterminados e achados médios de coortes anteriores, em vez de limiares individuais para a detecção de progressão em um animalespecífico4,5. Portanto, abordagens de imagem que permitam a avaliação longitudinal em animais vivos são necessárias para facilitar modelos pré-clínicos para testar novos fármacos ou compostos e acelerar o entendimento da fisiopatologia, além de aumentar o rigor e a reprodutibilidade6.
A ultrassonografia (US) é um método atraente para o monitoramento longitudinal da progressão do câncer uterino de camundongos, pois é relativamente fácil e barato em comparação com outros métodos de imagem, é fácil de realizar e pode ter resolução notável 6,7. Esta modalidade não invasiva pode capturar características à escala de mícrons em camundongos acordados ou com camundongos sob sedação breve usando um exame de 5-10 minutos. A microscopia ultrassônica foi validada como método para medir o desenvolvimento de folículos ovarianos de camundongos 8 e o crescimento de neoplasias implantadas ou induzidas 9,10,11. A US de alta frequência também tem sido utilizada para injeções intrauterinas percutâneas12 e observação de alterações uterinas em ratas ao longo do ciclo estral13. O US de alta frequência pode ser usado com ratos mantidos em plataformas estacionárias especializadas usando um sistema de trilho para segurar o transdutor/sonda para capturar imagens de alta resolução com posição e pressão padronizadas; no entanto, esse equipamento não está disponível em todas as instituições. Os métodos de varredura por transdutor portátil podem ser adotados com equipamentos menos dedicados e usados tanto para diagnósticos clínicos quanto para aplicações de pesquisa em camundongos.
Resta saber se as imagens dos EUA com sondas portáteis de alta frequência poderiam ser usadas para monitorar o desenvolvimento do câncer uterino ao longo de várias semanas. Semelhante aos intestinos, o útero do roedor é uma estrutura de paredes finas e delgadas, que é muito móvel dentro do abdômen e é contígua através de múltiplas profundidades de tecido, tornando a imagem mais desafiadora do que com órgãos relativamente imóveis, como os rins. Este estudo buscou estabelecer a correlação entre os tecidos observados pela ultrassonografia e histopatologia, definir pontos de referência para a localização do útero de camundongos e determinar a viabilidade da avaliação longitudinal do câncer de endométrio. Este estudo apresenta dados que mostram uma correspondência qualitativa entre a aparência das imagens uterinas por US e a histopatologia, bem como imagens seriadas de camundongos ao longo de várias semanas. Esses resultados indicam que o US portátil pode ser usado para monitorar o desenvolvimento do câncer de endométrio em camundongos, criando assim uma oportunidade para coletar dados longitudinais individuais de camundongos para estudar o câncer uterino sem a necessidade de equipamentos dedicados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo examina a utilidade da ultrassonografia para avaliar alterações morfológicas uterinas na progressão do adenocarcinoma no útero em camundongos. Neste estudo, ao acompanhar a indução do câncer de endométrio em camundongos longitudinalmente, os detalhes anatômicos detectados pela ultrassonografia mostraram-se indicadores de patologia macroscópica e histológica. Isso abre a porta para o uso de estudos longitudinais com um número menor de camundongos monitorados por ultrassom em vários pontos de t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pelo financiamento do NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, do programa de treinamento de pós-doutorado 5T32OD011089 e do Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. O projeto também foi parcialmente financiado pelos subsídios para despesas correntes para Instituições Privadas de Ensino Superior da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Privadas do Japão.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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