Denne artikel præsenterer to metoder baseret på fluorescens in situ hybridisering til bestemmelse af X-kromosomindholdet i ovarieceller i ikke-podet og podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser.
Millioner af mennesker verden over beskæftiger sig med spørgsmål vedrørende fertilitet. Nedsat fertilitet eller endda infertilitet kan skyldes mange forskellige årsager, herunder genetiske lidelser, hvoraf kromosomale abnormiteter er de mest almindelige. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en velkendt og hyppigt anvendt metode til at detektere kromosomafvigelser hos mennesker. FISH anvendes hovedsageligt til analyse af kromosomale abnormiteter i spermatozoer hos mænd med numeriske eller strukturelle kromosomale aberrationer. Desuden anvendes denne teknik også ofte hos kvinder til at detektere X-kromosomafvigelser, der vides at forårsage ovariedysgenese. Der mangler dog stadig oplysninger om X-kromosomindholdet i ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser i lymfocytter og/eller bukkalceller.
Formålet med denne undersøgelse er at fremme grundforskning vedrørende X-kromosomafvigelser hos kvinder ved at præsentere to metoder baseret på FISH til at identificere X-kromosomindholdet i ovarieceller. For det første beskrives en metode til bestemmelse af X-kromosomindholdet i isolerede ovarieceller (oocytter, granulosaceller og stromale celler) i ikke-podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser. Den anden metode er rettet mod at evaluere virkningen af kromosomafvigelser på follikulogenese ved at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller i nydannede sekundære og antrale follikler i ovarievæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser efter langvarig podning i immunkompromitterede mus. Begge metoder kan være nyttige i fremtidig forskning for at få indsigt i reproduktionspotentialet hos kvinder med X-kromosomafvigelser.
Infertilitet er et sundhedsproblem i det mandlige eller kvindelige reproduktive system, der påvirker ca. 186 millioner individer i reproduktiv alderverden over 1. I mindst 35% af infertile par er infertilitet forårsaget af en lidelse i det kvindelige reproduktive system2. Der er mange faktorer, der kan forårsage kvindelig infertilitet, såsom genetiske faktorer, genitale abnormiteter, endokrin dysfunktion, inflammatoriske sygdomme og iatrogen behandling3.
Genetiske abnormiteter er til stede hos ca. 10% af infertile kvinder 4,5. Af alle genetiske abnormiteter er X-kromosomafvigelser den mest almindelige årsag til ovariedysgenese2. Flere undersøgelser har rapporteret, at X-kromosomafvigelser hos kvinder med Turners syndrom (TS) eller Triple X syndrom er forbundet med for tidlig ovariesvigt på grund af et accelereret tab af kimceller eller nedsat oogenese 6,7,8.
Aberrationer af X-kromosomet kan opdeles i: 1) numeriske aberrationer, hvor antallet af X-kromosomer er anderledes, men X-kromosomerne er intakte; og 2) strukturelle aberrationer, hvor X-kromosomet har fået eller mistet genetisk materiale 3,9. Numeriske aberrationer af X-kromosomet er mere almindelige end strukturelle abnormiteter og skyldes ofte spontane fejl under celledeling 3,9. Når en sådan fejl opstår under meiose, kan det føre til aneuploide gameter og i sidste ende til afkom med kromosomafvigelser i alle celler. Når kromosomdefekter opstår i somatiske celler som følge af fejl, der opstår under mitose i de tidlige stadier af ontogenese, kan det føre til mosaikisme. I disse individer er både celler med normalt X-kromosomindhold og celler med X-kromosomafvigelser til stede.
I 1980’erne blev en cytogenetisk teknik kaldet fluorescens in situ hybridisering (FISH) udviklet til at visualisere og lokalisere specifikke nukleinsyresekvenser på metafase og interfasekromosomer10,11. Denne teknik bruger fluorescerende mærkede DNA-sonder til at binde til en bestemt sekvens i kromosomet, som derefter kan visualiseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
I dag anvendes FISH i vid udstrækning som et klinisk diagnostisk værktøj og betragtes som guldstandarden til påvisning af kromosomafvigelser10. Inden for reproduktiv medicin er FISH-analyse på sædceller blevet brugt til at få indsigt i X-kromosomindholdet i spermatozoer hos mænd med numeriske eller strukturelle kromosomafvigelser i somatiske celler12,13,14. Disse undersøgelser viste, at mænd med kromosomafvigelser var mere tilbøjelige til at have en højere frekvens af aneuploide spermatozoer til stede i deres sæd sammenlignet med mænd med normale karyotyper12,13,14.
I modsætning til spermatozoer er meget lidt kendt om X-kromosomindholdet i ovarieceller (herunder oocytter, granulosa / theca-celler og stromale celler) hos personer med kromosomafvigelse samt de mulige konsekvenser af aneuploidier af disse celler på deres reproduktive potentiale. En vigtig årsag til den knappe information om karyotypen af ovarieceller sammenlignet med spermatozoer er, at kvinder skal gennemgå en invasiv procedure såsom en follikelpunktur eller operation for at opnå oocytter eller ovariebarkvæv. Kvindelige kønsceller er derfor vanskelige at skaffe til forskningsformål.
I øjeblikket udføres et observationsinterventionsstudie i Holland for at undersøge effekten af kryopræservering af ovarievæv hos unge kvinder med TS15. Et fragment af patientens ovariebarkvæv var tilgængeligt for at identificere X-kromosomindholdet i ovariecellerne16,17. Som en del af undersøgelsen blev der udviklet en ny metode baseret på FISH af dissocieret ovariebarkvæv for at bestemme, om kromosomafvigelser er til stede i ovarieceller hos kvinder, der bærer en kromosomafvigelse i ikke-ovariesomatiske celler, såsom lymfocytter eller bukkalceller. Derudover blev virkningen af aneuploidier i ovarieceller på follikulogenese også bestemt. Til dette formål blev en etableret FISH-protokol modificeret, der muliggør analyse af histologiske sektioner af ovariebarkvæv efter kunstigt induceret follikulogenese under langvarig xenotransplantation hos immunkompromitterede mus. I denne undersøgelse præsenterer vi to metoder baseret på FISH til at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller i ikke-podet og podet ovariebarkvæv hos kvinder med X-kromosomafvigelser med det formål at forbedre grundvidenskaben om dette emne.
FISH-analyse er en velkendt teknik til påvisning af X-kromosomafvigelser i lymfocytter eller bukkalceller hos både mænd og kvinder10. Flere undersøgelser har beskrevet FISH på kønsceller hos mænd med X-kromosomafvigelser, men detaljerede oplysninger opnået af FISH om ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser mangler stadig14. Denne artikel præsenterer nye metoder baseret på FISH til at bestemme, om aneuploidier er til stede i ovariecellerne i ikke-podet og…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef og Milan Intezar for deres ekspertise og tekniske bistand. Finansieringskilder: Merck Serono (A16-1395), Goodlife og Ferring.
Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
Collagenase I | Sigma | 131470 | |
Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
DAPI | Vector | H-1200 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
EDTA | Merck | 108421 | |
Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
Hybridization Station | Dako | S2451 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
L15 | Lonza | 12-700Q | |
Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
Light microscope | Zeiss West Germany | ||
Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
Xylene | BOOM | 760518191000 |