Denne artikkelen presenterer to metoder basert på fluorescens in situ hybridisering for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik.
Millioner av mennesker over hele verden håndterer problemer knyttet til fruktbarhet. Redusert fruktbarhet, eller til og med infertilitet, kan skyldes mange forskjellige årsaker, inkludert genetiske lidelser, hvorav kromosomale abnormiteter er de vanligste. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en velkjent og hyppig brukt metode for å oppdage kromosomavvik hos mennesker. FISH brukes hovedsakelig til analyse av kromosomale abnormiteter i spermatozoa hos menn med numeriske eller strukturelle kromosomavvik. Videre er denne teknikken også ofte brukt hos kvinner for å oppdage X-kromosomale avvik som er kjent for å forårsake ovarial dysgenese. Det mangler imidlertid fortsatt informasjon om X-kromosominnholdet i ovarieceller fra hunner med X-kromosomavvik i lymfocytter og/eller bukkalceller.
Målet med denne studien er å fremme grunnforskning angående X-kromosomavvik hos kvinner, ved å presentere to metoder basert på FISH for å identifisere X-kromosominnholdet i eggstokkceller. Først beskrives en metode for å bestemme X-kromosominnholdet i isolerte eggstokkceller (oocytter, granulosaceller og stromale celler) i ikke-podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik. Den andre metoden er rettet mot å evaluere effekten av kromosomale avvik på follikulogenese ved å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller av nydannede sekundære og antralfollikler i eggstokkvev, fra kvinner med X-kromosomale avvik etter langvarig podning i immunkompromitterte mus. Begge metodene kan være nyttige i fremtidig forskning for å få innsikt i reproduksjonspotensialet til kvinner med X-kromosomavvik.
Infertilitet er et helseproblem av det mannlige eller kvinnelige reproduktive systemet, som påvirker omtrent 186 millioner individer i reproduktiv alder over hele verden1. I minst 35% av infertile par er infertilitet forårsaket av en lidelse i det kvinnelige reproduktivesystemet. Det er mange faktorer som kan forårsake kvinnelig infertilitet, for eksempel genetiske faktorer, kjønnsorganer, endokrin dysfunksjon, inflammatoriske sykdommer og iatrogen behandling3.
Genetiske abnormiteter er tilstede hos ca 10% av infertile kvinner 4,5. Av alle genetiske abnormiteter er X-kromosomavvik den vanligste årsaken til ovarial dysgenese2. Flere studier har rapportert at X-kromosomavvik hos kvinner med Turners syndrom (TS) eller Triple X-syndrom er assosiert med for tidlig eggstokksvikt på grunn av et akselerert tap av kimceller eller nedsatt oogenese 6,7,8.
Aberrasjoner av X-kromosomet kan deles inn i: 1) numeriske avvik, hvor antall X-kromosomer er forskjellige, men X-kromosomene er intakte; og 2) strukturelle avvik, der X-kromosomet har fått eller mistet genetisk materiale 3,9. Numeriske avvik i X-kromosomet er vanligere enn strukturelle avvik og skyldes ofte spontane feil under celledeling 3,9. Når en slik feil oppstår under meiose, kan det føre til aneuploide gameter og til slutt til avkom med kromosomale avvik i alle celler. Når kromosomdefekter oppstår i somatiske celler som følge av feil som oppstår under mitose i de tidlige stadier av ontogenese, kan det føre til mosaikk. Hos disse individene er både celler med normalt X-kromosominnhold og celler med X-kromosomavvik til stede.
På 1980-tallet ble en cytogenetisk teknikk kalt fluorescens in situ hybridisering (FISH) utviklet for å visualisere og lokalisere spesifikke nukleinsyresekvenser på metafase- og interfasekromosomer10,11. Denne teknikken bruker fluorescerende merkede DNA-prober for å binde seg til en bestemt sekvens i kromosomet, som deretter kan visualiseres ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
I dag er FISH mye brukt som et klinisk diagnostisk verktøy og regnes som gullstandarden for å oppdage kromosomavvik10. Innen reproduksjonsmedisin har FISH-analyse på sædceller blitt brukt for å få innsikt i X-kromosominnholdet i spermatozoer hos menn med numeriske eller strukturelle kromosomavvik i somatiske celler12,13,14. Disse studiene viste at menn med kromosomavvik var mer sannsynlig å ha en høyere frekvens av aneuploide spermatozoer tilstede i sæden sammenlignet med menn med normale karyotyper12,13,14.
I motsetning til spermatozoer er svært lite kjent om X-kromosominnholdet i eggstokkceller (inkludert oocytter, granulosa / theca-celler og stromale celler) hos individer med kromosomavvik, samt de mulige konsekvensene av aneuploidi av disse cellene på deres reproduktive potensial. En viktig årsak til den knappe informasjonen om karyotypen av eggstokkceller sammenlignet med spermatozoa er det faktum at kvinner må gjennomgå en invasiv prosedyre som en follikelpunktering eller kirurgi for å oppnå oocytter eller eggstokkvev. Kvinnelige kjønnsceller er derfor vanskelig å få tak i for forskningsformål.
For tiden utføres en observasjonsintervensjonsstudie i Nederland for å undersøke effekten av kryopreservering av eggstokkvev hos unge kvinner med TS15. Ett fragment av ovariecortexvevet til pasienten var tilgjengelig for å identifisere X-kromosominnholdet i eggstokkcellene16,17. Som en del av studien ble det utviklet en ny metode basert på FISH av dissociert ovariecortexvev for å avgjøre om kromosomale avvik er tilstede i eggstokkceller hos kvinner som bærer en kromosomavvik i ikke-ovarie somatiske celler, som lymfocytter eller bukkalceller. I tillegg ble effekten av aneuploidi i eggstokkceller på follikulogenese også bestemt. For dette formål ble en etablert FISH-protokoll modifisert som muliggjør analyse av histologiske seksjoner av ovariecortexvev etter kunstig indusert follikulogenese under langvarig xenotransplantasjon hos immunkompromitterte mus. I denne studien presenterer vi to metoder basert på FISH for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev hos kvinner med X-kromosomavvik, med sikte på å forbedre grunnleggende vitenskap om dette emnet.
FISH-analyse er en velkjent teknikk for å påvise X-kromosomavvik i lymfocytter eller bukkalceller hos både hanner og hunner10. Flere studier har beskrevet FISH på kjønnsceller fra hanner med X-kromosomavvik, men detaljert informasjon innhentet av FISH på eggstokkceller fra hunner med X-kromosomavvik mangler fortsatt14. Denne artikkelen presenterer nye metoder basert på FISH for å avgjøre om aneuploidi er tilstede i eggstokkceller av ikke-podet og podet ovariecortex…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef og Milan Intezar for deres ekspertise og tekniske assistanse. Finansieringskilder: Merck Serono (A16-1395), Goodlife og Ferring.
Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
Collagenase I | Sigma | 131470 | |
Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
DAPI | Vector | H-1200 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
EDTA | Merck | 108421 | |
Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
Hybridization Station | Dako | S2451 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
L15 | Lonza | 12-700Q | |
Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
Light microscope | Zeiss West Germany | ||
Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
Xylene | BOOM | 760518191000 |