Denne protokol beskriver isoleringen af pulmonale interstitielle makrofager (IM’er) og deres adoptive overførsel efter IL-33-stimulering af lungealveolerne i en musemodel, hvilket kan lette in vivo-undersøgelsen af idiopatisk lungefibrose (IPF).
Det inflammatoriske respons forårsaget af tidlig lungeskade er en af de vigtige årsager til udviklingen af idiopatisk lungefibrose (IPF), som ledsages af aktivering af inflammatoriske celler såsom makrofager og neutrofiler samt frigivelse af inflammatoriske faktorer, herunder TNF-α, IL-1β og IL-6. Tidlig inflammation forårsaget af aktiverede pulmonale interstitielle makrofager (IM’er) som reaktion på IL-33-stimulering er kendt for at spille en afgørende rolle i den patologiske proces af IPF. Denne protokol beskriver den adoptive overførsel af IM’er stimuleret af IL-33 til lungerne hos mus for at studere IPF-udvikling. Det involverer isolering og dyrkning af primære IM’er fra værtsmuselunger, efterfulgt af adoptiv overførsel af stimulerede IM’er til alveolerne hos bleomycin (BLM)-inducerede IPF-modtagermus (som tidligere er blevet udtømt for alveolære makrofager ved behandling med clodronatliposomer) og patologisk evaluering af disse mus. De repræsentative resultater viser, at adoptiv overførsel af IL-33-stimulerede makrofager forværrer lungefibrose hos mus, hvilket tyder på, at etableringen af makrofagadoptivoverførselseksperimentet er et godt teknisk middel til at studere IPF-patologi.
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en diffus lungeinflammatorisk sygdom forårsaget af mange faktorer1. I cytokinmikromiljøet af Th1- og Th2-immunresponset kan makrofager polariseres til klassisk aktiverede makrofager (M1) og alternativt aktiverede makrofager (M2). Lipopolysaccharider (LPS) eller cytokinet IFN- γ inducerer M1-makrofager til at polarisere og producere proinflammatoriske cytokiner, herunder iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α og IL-12. I modsætning hertil driver type II-cytokinerne IL-4 og IL-13 polariseringen af M2-makrofager, som kan producere forskellige fibroblastvækstfremmende faktorer, såsom TGF-β og PDGF, der fremmer lungefibrose2. Den patologiske proces af IPF ledsages af makrofagaktivering og infiltration. IPF formidler skadereparation, inflammation og fibrose gennem frigivelse af cytokiner3. Da der kun er begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed, har udforskning af IPF’s molekylærpatologiske mekanismer stor betydning for udviklingen af nye strategier for IPF-forebyggelse og -behandling. Tidligere undersøgelser foretaget af vores gruppe og andre forskere 4,5 har bekræftet den øgede frigivelse af IL-33 hos IPF-patienter og i musemodeller med bleomycin (BLM)-induceret IPF. IL-33 frigives af epitel- og endotelcellerne under fibrose og er involveret i makrofagaktivering, hvilket resulterer i unormal proliferation af fibroblaster, leukocytinfiltration og eventuelt tab af lungefunktion5. Den nuværende protokol beskriver den adoptive overførsel af IL-33-stimulerede interstitielle makrofager (IM’er) til alveolerne som et middel til at studere IPF-udvikling i musemodeller. Her blev IM’er isoleret fra lungevævet hos værtsmus, dyrket in vitro, stimuleret med IL-33 i 24 timer og derefter adoptivt overført til alveolerne hos modtagermus ved trakealinjektion. Den direkte indsamling af stimulerede musemakrofager og deres adoptive overførsel til modtageralveolerne viste sig at forværre graden af lungefibrose og kan tydeligere illustrere stimulerende faktorers indflydelse på fibrose sammenlignet med de tidligere undersøgelser6. Teknikken beskrevet i denne artikel kan gøre det muligt for forskere at udforske funktionen af makrofager stimuleret af potentielle cytokiner i udviklingen af IPF.
Denne undersøgelse giver en effektiv metode til at nedbryde, isolere, dyrke og overføre makrofager, hvilket kan hjælpe med at studere mekanismerne for lungefibrose hos mus. Der er mange metoder til udtømning af musemakrofager, såsom trakeal administration, haleveneinjektion og nasal indånding11. Denne undersøgelse optimerede den nasale inhalationsmetode, som er enkel at betjene og effektivt kan nedbryde lungemakrofager 8,9. Efter IL…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender det særlige emne for laboratoriestyring af Jiangnan University: Konstruktion af digitalt skivebibliotek baseret på patologiske prøver (JDSYS202223) og National Natural Science Foundation of China (81800065).
DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |