Adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen naar bleomycine-geïnduceerde muismodellen om hun effect op idiopathische longfibrose in vivo te bestuderen
Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van pulmonale interstitiële macrofagen (IM’s) en hun adoptieve overdracht na IL-33 stimulatie van de longblaasjes in een muismodel, wat de in vivo studie van idiopathische longfibrose (IPF) kan vergemakkelijken.
Abstract
De ontstekingsreactie veroorzaakt door vroege longbeschadiging is een van de belangrijke oorzaken van de ontwikkeling van idiopathische longfibrose (IPF), die gepaard gaat met de activering van ontstekingscellen zoals macrofagen en neutrofielen, evenals de afgifte van ontstekingsfactoren zoals TNF-α, IL-1β en IL-6. Van vroege ontsteking veroorzaakt door geactiveerde pulmonale interstitiële macrofagen (IM’s) als reactie op IL-33-stimulatie is bekend dat ze een vitale rol spelen in het pathologische proces van IPF. Dit protocol beschrijft de adoptieve overdracht van IM’s gestimuleerd door IL-33 in de longen van muizen om IPF-ontwikkeling te bestuderen. Het omvat de isolatie en kweek van primaire IM’s uit de longen van gastheermuizen, gevolgd door de adoptieve overdracht van gestimuleerde IM’s in de longblaasjes van bleomycine (BLM) -geïnduceerde IPF-ontvangermuizen (die eerder zijn uitgeput van alveolaire macrofagen door behandeling met clodronate liposomen), en de pathologische evaluatie van die muizen. De representatieve resultaten tonen aan dat de adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen longfibrose bij muizen verergert, wat suggereert dat de oprichting van het macrofaag adoptieve transferexperiment een goed technisch middel is om IPF-pathologie te bestuderen.
Introduction
Idiopathische longfibrose (IPF) is een diffuse longontstekingsziekte veroorzaakt door vele factoren1. In de cytokine micro-omgeving van de Th1 en Th2 immuunrespons kunnen macrofagen worden gepolariseerd in klassiek geactiveerde macrofagen (M1) en alternatief geactiveerde macrofagen (M2). Lipopolysacchariden (LPS) of het cytokine IFN-γ induceren M1-macrofagen om te polariseren en pro-inflammatoire cytokines te produceren, waaronder iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α en IL-12. Daarentegen drijven de type II-cytokines IL-4 en IL-13 de polarisatie van M2-macrofagen aan, die verschillende fibroblastgroeibevorderende factoren kunnen produceren, zoals TGF-β en PDGF, die longfibrose2 bevorderen. Het pathologische proces van IPF gaat gepaard met macrofaagactivering en infiltratie. IPF bemiddelt letselherstel, ontsteking en fibrose door de afgifte van cytokines3. Omdat er slechts beperkte therapeutische opties beschikbaar zijn, is het verkennen van de moleculaire pathologische mechanismen van IPF van groot belang voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor IPF-preventie en -behandeling. Eerdere studies door onze groep en andere onderzoekers 4,5 hebben de verhoogde afgifte van IL-33 bevestigd bij IPF-patiënten en in muismodellen met bleomycine (BLM)-geïnduceerde IPF. IL-33 wordt vrijgegeven door de epitheel- en endotheelcellen tijdens fibrose en is betrokken bij macrofaagactivatie, wat resulteert in de abnormale proliferatie van fibroblasten, leukocyteninfiltratie en het uiteindelijke verlies van longfunctie5. Het huidige protocol beschrijft de adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde interstitiële macrofagen (IM’s) in de longblaasjes als een middel om IPF-ontwikkeling in muismodellen te bestuderen. Hier werden IM’s geïsoleerd uit het longweefsel van gastheermuizen, in vitro gekweekt, gestimuleerd met IL-33 gedurende 24 uur en vervolgens adoptief overgebracht in de longblaasjes van ontvangende muizen door tracheale injectie. De directe verzameling van gestimuleerde muizenmacrofagen en hun adoptieve overdracht naar de ontvangende longblaasjes bleek de mate van longfibrose te verergeren en kan de invloed van stimulerende factoren op fibrose duidelijker illustreren in vergelijking met de eerdere studies6. De techniek die in dit artikel wordt beschreven, kan onderzoekers in staat stellen om de functie van macrofagen gestimuleerd door potentiële cytokines bij de ontwikkeling van IPF te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie biedt een effectieve methode om macrofagen uit te putten, te isoleren, te kweken en over te dragen, wat kan helpen bij het bestuderen van de mechanismen van longfibrose bij muizen. Er zijn veel methoden voor macrofaagdepletie bij muizen, zoals tracheale toediening, staartaderinjectie en neusinhalatie11. Deze studie optimaliseerde de nasale inhalatiemethode, die eenvoudig te bedienen is en pulmonale macrofagen effectief kan uitputten 8,9<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen het speciale onderwerp van laboratoriumbeheer van Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) en de National Natural Science Foundation of China (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
