Summary

Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalen interstitiellen Makrophagen (IMs) und deren adoptiven Transfer nach IL-33-Stimulation der Lungenbläschen in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) erleichtern kann.

Abstract

Die Entzündungsreaktion, die durch eine frühe Lungenschädigung verursacht wird, ist eine der wichtigsten Ursachen für die Entwicklung einer idiopathischen Lungenfibrose (IPF), die mit der Aktivierung von Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen sowie der Freisetzung von Entzündungsfaktoren wie TNF-α, IL-1β und IL-6 einhergeht. Es ist bekannt, dass eine frühe Entzündung, die durch aktivierte pulmonale interstitielle Makrophagen (IMs) als Reaktion auf die IL-33-Stimulation verursacht wird, eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der IPF spielt. Dieses Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IMs, die durch IL-33 stimuliert werden, in die Lunge von Mäusen, um die IPF-Entwicklung zu untersuchen. Es beinhaltet die Isolierung und Kultivierung von primären IMs aus der Lunge der Wirtsmaus, gefolgt von der adoptiven Übertragung von stimulierten IMs in die Alveolen von Bleomycin-induzierten IPF-Empfängermäusen (die zuvor durch die Behandlung mit Clodronat-Liposomen an Alveolarmakrophagen erschöpft waren) und die pathologische Bewertung dieser Mäuse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass der adoptive Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen die Lungenfibrose bei Mäusen verschlimmert, was darauf hindeutet, dass die Etablierung des Makrophagen-Adoptivtransfer-Experiments ein gutes technisches Mittel zur Untersuchung der IPF-Pathologie ist.

Introduction

Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine diffuse pulmonale entzündliche Erkrankung, die durch viele Faktoren verursacht wird1. In der Zytokin-Mikroumgebung der Th1- und Th2-Immunantwort können Makrophagen in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) und alternativ aktivierte Makrophagen (M2) polarisiert werden. Lipopolysaccharide (LPS) oder das Zytokin IFN-γ induzieren M1-Makrophagen, um proinflammatorische Zytokine, einschließlich iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α und IL-12, zu polarisieren und zu produzieren. Im Gegensatz dazu treiben die Typ-II-Zytokine IL-4 und IL-13 die Polarisation von M2-Makrophagen an, die verschiedene wachstumsfördernde Faktoren wie TGF-β und PDGF produzieren können, die die Lungenfibrosefördern 2. Der pathologische Prozess der IPF wird von der Aktivierung und Infiltration von Makrophagen begleitet. IPF vermittelt die Reparatur von Verletzungen, Entzündungen und Fibrose durch die Freisetzung von Zytokinen3. Da nur begrenzte Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen, ist die Erforschung der molekularpathologischen Mechanismen der IPF von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien zur Prävention und Behandlung von IPF. Frühere Studien unserer Gruppe und anderer Forscher 4,5 haben die erhöhte Freisetzung von IL-33 bei IPF-Patienten und in Mausmodellen mit Bleomycin (BLM)-induziertem IPF bestätigt. IL-33 wird während der Fibrose von den Epithel- und Endothelzellen freigesetzt und ist an der Aktivierung von Makrophagen beteiligt, was zu einer abnormalen Proliferation von Fibroblasten, einer Leukozyteninfiltration und schließlich zum Verlust der Lungenfunktion führt5. Das aktuelle Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IL-33-stimulierten interstitiellen Makrophagen (IMs) in die Alveolen als Mittel zur Untersuchung der IPF-Entwicklung in Mausmodellen. Hier wurden IMs aus dem Lungengewebe von Wirtsmäusen isoliert, in vitro kultiviert, 24 h lang mit IL-33 stimuliert und dann adoptiv durch Trachealinjektion in die Alveolen der Empfängermäuse übertragen. Es wurde festgestellt, dass die direkte Entnahme von stimulierten Mausmakrophagen und deren adoptiver Transfer in die Empfängeralveolen den Grad der Lungenfibrose verschlimmert und den Einfluss stimulierender Faktoren auf die Fibrose im Vergleich zu den vorherigen Studien deutlicher veranschaulichenkann 6. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik kann es Forschern ermöglichen, die Funktion von Makrophagen, die durch potenzielle Zytokine stimuliert werden, bei der Entwicklung von IPF zu untersuchen.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für experimentellen Tierschutz der Universität Jiangnan genehmigt (JN Nr. 20211,130m1720615[501]). HINWEIS: Insgesamt wurden in dieser Studie 10 männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Die drei Versuchsgruppen in der Studie umfassten jeweils drei Empfängerm…

Representative Results

Das hier verwendete Protokoll ist im Flussdiagramm in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Inhalation von Clodronat-Liposomen durch die Nase (Abbildung 2) wurde verwendet, um die Lungenmakrophagen von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zu erschöpfen, und dies führte zu einem guten Empfänger-Mausmodell. Pulmonale IMs wurden von einer anderen unbehandelten (Wirts-)Maus isoliert (Abbildung 3A, B) und in vitro kultivi…

Discussion

Diese Studie bietet eine effektive Methode zum Abbauen, Isolieren, Kultivieren und Übertragen von Makrophagen, die bei der Untersuchung der Mechanismen der Lungenfibrose bei Mäusen helfen kann. Es gibt viele Methoden zur Verarmung von Mausmakrophagen, wie z. B. die Verabreichung von Trachealgefäßen, die Injektion von Schwanzvenen und die Naseninhalation11. Diese Studie optimierte die nasale Inhalationsmethode, die einfach zu bedienen ist und Lungenmakrophagen effektiv abbauen kann<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen das Special Topic of Laboratory Management der Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) und der National Natural Science Foundation of China (81800065).

Materials

 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

References

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Cite This Article
Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

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