Adoptiv överföring av IL-33-stimulerade makrofager till bleomycininducerade musmodeller för att studera deras effekt på idiopatisk lungfibros in vivo
Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av pulmonella interstitiella makrofager (IM) och deras adoptiva överföring efter IL-33-stimulering av lungalveolerna i en musmodell, vilket kan underlätta in vivo-studien av idiopatisk lungfibros (IPF).
Abstract
Det inflammatoriska svaret som orsakas av tidig lungskada är en av de viktiga orsakerna till utvecklingen av idiopatisk lungfibros (IPF), som åtföljs av aktivering av inflammatoriska celler såsom makrofager och neutrofiler, liksom frisättning av inflammatoriska faktorer inklusive TNF-α, IL-1β och IL-6. Tidig inflammation orsakad av aktiverade pulmonella interstitiella makrofager (IM) som svar på IL-33-stimulering är känd för att spela en viktig roll i den patologiska processen för IPF. Detta protokoll beskriver adoptiv överföring av IM stimulerad av IL-33 till lungorna hos möss för att studera IPF-utveckling. Det innefattar isolering och odling av primära IM från värdmuslungor, följt av adoptiv överföring av stimulerade IM till alveolerna hos bleomycin (BLM)-inducerade IPF-mottagarmöss (som tidigare har utarmats av alveolära makrofager genom behandling med klodronatliposomer) och den patologiska utvärderingen av dessa möss. De representativa resultaten visar att adoptiv överföring av IL-33-stimulerade makrofager förvärrar lungfibros hos möss, vilket tyder på att etableringen av makrofagöverföringsexperimentet är ett bra tekniskt sätt att studera IPF-patologi.
Introduction
Idiopatisk lungfibros (IPF) är en diffus lunginflammatorisk sjukdom som orsakas av många faktorer1. I cytokinmikromiljön i Th1- och Th2-immunsvaret kan makrofager polariseras till klassiskt aktiverade makrofager (M1) och alternativt aktiverade makrofager (M2). Lipopolysackarider (LPS) eller cytokinet IFN-γ inducerar M1-makrofager att polarisera och producera proinflammatoriska cytokiner, inklusive iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α och IL-12. Däremot driver typ II-cytokinerna IL-4 och IL-13 polariseringen av M2-makrofager, som kan producera olika fibroblasttillväxtfrämjande faktorer, såsom TGF-β och PDGF, som främjar lungfibros2. Den patologiska processen med IPF åtföljs av makrofagaktivering och infiltration. IPF förmedlar skadereparation, inflammation och fibros genom frisättning av cytokiner3. Eftersom endast begränsade terapeutiska alternativ finns tillgängliga, har utforskandet av de molekylärpatologiska mekanismerna för IPF stor betydelse för att utveckla nya strategier för förebyggande och behandling av IPF. Tidigare studier av vår grupp och andra forskare 4,5 har bekräftat den ökade frisättningen av IL-33 hos IPF-patienter och i musmodeller med bleomycin (BLM)-inducerad IPF. IL-33 frigörs av epitel- och endotelcellerna under fibros och är involverad i makrofagaktivering, vilket resulterar i onormal spridning av fibroblaster, leukocytinfiltration och eventuell förlust av lungfunktion5. Det nuvarande protokollet beskriver adoptiv överföring av IL-33-stimulerade interstitiella makrofager (IM) till alveolerna som ett sätt att studera IPF-utveckling i musmodeller. Här isolerades IM från lungvävnaden hos värdmöss, odlades in vitro, stimulerades med IL-33 i 24 timmar och överfördes sedan adoptivt till alveolerna hos mottagarmöss genom trakealinjektion. Den direkta insamlingen av stimulerade musmakrofager och deras adoptiva överföring till mottagaralveolerna visade sig förvärra graden av lungfibros och kan tydligare illustrera påverkan av stimulerande faktorer på fibros jämfört med tidigare studier6. Tekniken som beskrivs i denna artikel kan göra det möjligt för forskare att utforska funktionen av makrofager stimulerade av potentiella cytokiner i utvecklingen av IPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie ger en effektiv metod för att tömma, isolera, odla och överföra makrofager, vilket kan hjälpa till att studera mekanismerna för lungfibros hos möss. Det finns många metoder för utarmning av musmakrofag, såsom trakealadministrering, svansveninjektion och nasal inandning11. Denna studie optimerade den nasala inhalationsmetoden, som är enkel att använda och effektivt kan tömma lungmakrofager 8,9. Efter IL-33-stimuler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner det särskilda ämnet laboratoriehantering vid Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) och National Natural Science Foundation of China (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
